植物內(nèi)生真菌來源抗菌物質(zhì)的篩選及產(chǎn)ECB側(cè)鏈酰胺水解酶基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)已成為醫(yī)院感染的主要病原菌并遍布全世界，是臨床抗感染治療的難題。盡管現(xiàn)在有萬古霉素、替考拉寧、利福平等一些治療MRSA的藥物，但MRSA通過多種機(jī)制產(chǎn)生耐藥性，目前尚未研制出對MRSA強(qiáng)效的新型抗生素，尋找新的藥物開發(fā)前體是亟待解決的問題。植物內(nèi)生真菌普遍存在于健康植物組織中，種類繁多，具有多種多樣的活性功能，其中

2、很重要的一點(diǎn)就是抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)室嘗試從植物內(nèi)生真菌當(dāng)中尋找拮抗MRSA的活性菌株并研究發(fā)酵條件的最優(yōu)化，為今后研制治療MRSA的藥物打下了工作基礎(chǔ)。
　　 我們采用固體發(fā)酵的方法，對529株植物內(nèi)生真菌（植物主要涉及柴胡、小麥、番茄、水稻、當(dāng)歸、千金藤、連翹、元寶草、朱砂根、杜仲、野雞尾、牡丹、藿香等）進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵周期為14d，乙酸乙酯抽提發(fā)酵產(chǎn)物，并用枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、白色念珠菌（Candi

3、date albicans）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）、藤黃八疊球菌（Sahroeter lutea）、大腸桿菌(Escherichia coli)5種常見病原菌作為鑒定菌，紙片瓊脂擴(kuò)散法檢測所制備的發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性。發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物抽提液抗大腸桿菌的菌株為50株、抗白色念珠菌的為66株、抗金黃色葡萄球菌的為262株、抗藤黃八疊球菌的為124株、抗枯草桿菌的為159株。又采用MRSA作為鑒定菌，選取了55

4、株具有較廣抑菌譜的植物內(nèi)生菌進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果顯示19株具有抗MRSA活性。
　　 而后我們選取了1株具有廣譜抗菌活性的內(nèi)生真菌SIPI3.0070進(jìn)行菌種鑒定，該菌拮抗革蘭氏陽性菌(包括MRSA)和真菌。通過形態(tài)和培養(yǎng)特性觀察(3d、7d菌落形態(tài)及顯微形態(tài))，初步鑒定該菌屬于曲霉菌屬（Aspergillus）當(dāng)中的煙曲霉，接著利用分子生物學(xué)方法，將SIPI3.0070菌株的18S rDNA序列測序，并向GenBank進(jìn)行了提交，其

5、序列登記號為FJ864683，序列比對同源性最高的也是煙曲霉(同源性100％)，最終鑒定SIPI3.0070是煙曲霉。同時(shí)還對該菌培養(yǎng)及抽提條件進(jìn)行了優(yōu)化，以抑菌圈大小作為評判標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示以小米作為固體培養(yǎng)基，發(fā)酵周期14 d，采用乙酸乙酯抽提培養(yǎng)物，抽提液抗革蘭氏陽性菌活性較高，采用甲醇抽提發(fā)酵物，抽提液抗真菌效果較高，本工作為進(jìn)一步抽提該菌抗菌活性化合物奠定了基礎(chǔ)。
　　 猶他游動(dòng)放線菌(Actinoplanes utah

6、ensis)發(fā)酵產(chǎn)生的酰胺水解酶，可以水解棘白菌素Bo（簡稱ECB）的溶血性的亞油酰側(cè)鏈而得到ECB母核，然后經(jīng)過一系列的化學(xué)修飾，最終得到抗真菌藥物阿尼芬凈。查閱文獻(xiàn)報(bào)道，目前我國基本采用游動(dòng)放線菌發(fā)酵法來獲取ECB酰胺水解酶，尚無相關(guān)的通過基因工程的方法獲得ECB酰胺水解酶。由于基因工程方法運(yùn)用成熟，且相對于傳統(tǒng)發(fā)酵法，更加理性和定向，因此，建立基因工程程菌來產(chǎn)生ECB酰胺水解酶顯得尤為重要。
　　 本實(shí)驗(yàn)室采用兩種基因工程

7、菌構(gòu)建策略，一種策略是從保存的猶他游動(dòng)放線菌（Actinoplanes utahensis）SIPI-A.2001基因組中克隆到ECB酰胺水解酶及其上下游基因（大約4kb），EcoR I和XbaI雙酶切該基因與pSP72質(zhì)粒，連接，構(gòu)建成pCQ-02-44-1質(zhì)粒，基因測序與網(wǎng)上相應(yīng)ECB酰胺水解酶序列同源性達(dá)99.8％。接下來用EeoR I和XbaI酶切出4kb片段和pTGV2線性片段，連接，構(gòu)建出含有ECB酰胺水解酶及上下游基因的p

8、TGV2質(zhì)粒，命名為pCQ-03-11-1，通過接合轉(zhuǎn)移的方法將此表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到模式變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)TK24中，種子培養(yǎng)2d，發(fā)酵培養(yǎng)5d，離心清洗收集菌絲，靜息細(xì)胞法轉(zhuǎn)化ECB底物，轉(zhuǎn)化時(shí)間5h，轉(zhuǎn)化溫度30℃，底物濃度2mg/mL。HPLC檢測表明，我們構(gòu)建的基因工程菌可以有效水解ECB亞油酰側(cè)鏈，最高轉(zhuǎn)化率達(dá)53.2％，猶他游動(dòng)放線菌轉(zhuǎn)化率是11.74％，基因工程菌轉(zhuǎn)化效率要比野生型游動(dòng)放

9、線菌轉(zhuǎn)化率提高近5倍。另一種策略是只克隆ECB酰胺水解酶基因(大約2.8kb)，網(wǎng)上序列比對同源性為99.8％，再克隆紅霉素強(qiáng)啟動(dòng)子(ermEp)基因，序列比對同源性為100％，通過酶切連接，構(gòu)建含有紅霉素啟動(dòng)子和ECB酰胺水解酶的克隆質(zhì)粒，導(dǎo)入到表達(dá)質(zhì)粒pTGV2。另外我們還構(gòu)建了含有ECB酰胺水解酶及其上下游基因的pSET152表達(dá)質(zhì)粒，含有ECB酰胺水解酶及紅霉素啟動(dòng)子的pTGV2表達(dá)質(zhì)粒。本文工作為下一步利用基因工程菌轉(zhuǎn)化ECB