由吸水鏈霉菌ATCC29253構(gòu)建主要產(chǎn)橄欖素的基因工程菌.pdf

1、目的:
　　 洋橄欖素是1959年從生孢鏈霉菌中首次分離得到的。它具有免疫抑制、抗革蘭陽性菌、抗線蟲、抗原生動(dòng)物、和抗腫瘤細(xì)胞等多種生物學(xué)活性，與化學(xué)藥劑相比，安全性高，治療效果好，易降解，對(duì)環(huán)境污染小，并且現(xiàn)已進(jìn)入臨床應(yīng)用。
　　 近年來，免疫抑制劑生物合成基因簇的研究引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。鏈霉菌基因工程技術(shù)的發(fā)展，使得克隆次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因、有目的地進(jìn)行基因重組和基因定向改造、提高菌種的生產(chǎn)能力、產(chǎn)生新的代謝

2、產(chǎn)物成為可能。
　　 而吸水鏈霉菌具有廣泛的生物學(xué)活性，其代謝產(chǎn)物在臨床中具有重要的應(yīng)用價(jià)值?；蚬こ碳夹g(shù)在大環(huán)內(nèi)酯類抗生素研究中的應(yīng)用，已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。通過基因工程的方法改造微生物代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與組成，對(duì)解決當(dāng)前日益嚴(yán)重的致病菌耐藥性問題帶來了新的希望。
　　 由于一種微生物同時(shí)產(chǎn)生幾種不同的抗生素，給工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)帶來了較大的困難。選育單組分活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌，可以從遺傳上選擇性地只生產(chǎn)一種特定的生物活性

3、物質(zhì)，而不再產(chǎn)生其他的活性成分，這樣的菌種具有產(chǎn)物單一，生產(chǎn)過程簡單，易于提取純化以及降低生產(chǎn)成本等許多優(yōu)點(diǎn)。
　　 本研究采用分子生物學(xué)的方法使產(chǎn)生兩種主要抗生素—雷帕霉素和洋橄欖素的吸水鏈霉菌通過失活雷帕霉素生物合成基因簇中的rapA基因，阻斷該產(chǎn)物的生物合成，從而獲得主要產(chǎn)洋橄欖素的基因工程菌，提高洋橄欖素的產(chǎn)量。此外，本研究對(duì)獲得的基因工程菌株進(jìn)行自然分離，以得到遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。
　　 方法:
　　

4、 一、質(zhì)粒pG07的構(gòu)建
　　 以吸水鏈霉菌ATCC29253的染色體為模板，通過PCR擴(kuò)增rapA基因片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后分別與pMD18-T質(zhì)粒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后得到陽性克隆，然后將得到的陽性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后提質(zhì)粒，并將得到的重組質(zhì)粒用酶切來驗(yàn)證插入方向，選擇正確插入方向的質(zhì)粒分別命名為pG01和pG04。然后再次將質(zhì)粒pG01和pG04酶切，選擇目的片段進(jìn)行膠回收再與pKC1139酶切后的片段16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化E

5、.coli DH-5α感受態(tài)。通過抗性篩選得到陽性克隆，擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)菌并提取純化獲得重組質(zhì)粒pG07。
　　 二、接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)
　　 將具有大腸桿菌-鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移功能的重組質(zhì)粒pG07轉(zhuǎn)化E.coli ET12567(pUZ8002)，篩選陽性克隆。經(jīng)一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)后與經(jīng)過50℃熱激活的出發(fā)菌株吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus ATCC29253）單孢子懸液混合，涂布于2CM平板上，16小

6、時(shí)后，用一定濃度的安普霉素和萘啶酮酸水溶液覆蓋，28℃繼續(xù)培養(yǎng)。7天后觀察是否有陽性克隆長出。
　　 三、雙交換菌株的篩選
　　 挑取接合轉(zhuǎn)移后的陽性克隆菌落，涂布在含有安普霉素的MYM平板上培養(yǎng)。收集孢子制備成孢子懸液，稀釋一定倍數(shù)后涂布于含有安普霉素的MYM平板上，28℃培養(yǎng)48-72小時(shí)，在未形成氣生菌絲時(shí)，將平板移至42℃繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，能夠繼續(xù)生長的菌株即為單交換菌株。
　　 將單交換菌株在不添加抗生

7、素的MYM平板上傳代，篩選失去安普霉素抗性的菌株即為雙交換重組菌株。
　　 四、重組菌株的HPLC分析
　　 將篩選出的雙交換重組菌株與出發(fā)菌株分別傳于斜面培養(yǎng)基上，再接種于種子搖瓶內(nèi)，于28℃培養(yǎng)40小時(shí)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵搖瓶，于28℃培養(yǎng)5天。
　　 發(fā)酵液提取物采用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果:
　　 一、質(zhì)粒pG07的酶切鑒定
　　 將質(zhì)粒pG07進(jìn)行酶切驗(yàn)證，并以pG0

8、7為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。酶切及PCR產(chǎn)物采用0.8％瓊脂糖凝膠電泳，圖譜顯示酶切后片段的長度與預(yù)期結(jié)果一致，并且PCR擴(kuò)增出的片段大小約2853bp，正好為基因缺失后的長度，說明質(zhì)粒pG07構(gòu)建正確。
　　 二、接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)
　　 E.coli ET12567(pUZ8002，pG07)與吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicusATCC29253）共同培養(yǎng)后，在有安普霉素的平皿上有鏈霉菌的陽

9、性克隆長出，說明質(zhì)粒pG07攜帶的安普霉素抗性基因已經(jīng)在鏈霉菌中表達(dá)，質(zhì)粒pG07已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到吸水鏈霉菌ATCC29253中。
　　 三、雙交換菌株的篩選及高效液相色譜(HPLC)的分析結(jié)果
　　 對(duì)重組菌株染色體進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，重組質(zhì)粒上失活的rapA基因與出發(fā)菌株染色體上正常的rapA基因發(fā)生了正確的同源雙交換。
　　 發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析表明:基因重組菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中雷帕霉素的產(chǎn)量顯著減少

10、了62％，而另一代謝產(chǎn)物洋橄欖素的產(chǎn)量有所提高。
　　 結(jié)論:
　　 1、成功地刪除了吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus ATCC29253）中雷帕霉素生物合成基因簇中的rapA基因的內(nèi)部片段，造成rapA基因的失活，得到了基因重組菌株。經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析表明:重組菌株雷帕霉素產(chǎn)量顯著減少而洋橄欖素產(chǎn)量有所提高。
　　 2、對(duì)重組菌株染色體DNA上的rapA基因進(jìn)行了PCR驗(yàn)證