小鼠胸腺微環(huán)境對(duì)外源性抗原的免疫應(yīng)答.pdf

1、研究背景與目的:
　　 胸腺對(duì)異種抗原細(xì)胞發(fā)生的免疫排斥現(xiàn)象，是在前期研究胸腺耐受的研究發(fā)現(xiàn)的。迄今為止，普遍的理論認(rèn)為胸腺是一個(gè)免疫“特赦”器官。T細(xì)胞前期在胸腺內(nèi)的發(fā)育和分化是一個(gè)抗原非依賴階段，此時(shí)接觸抗原易發(fā)生凋亡或耐受，當(dāng)其成熟后即遷移至外周的免疫器官，在抗原誘導(dǎo)下產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此對(duì)胸腺內(nèi)可能發(fā)生的免疫機(jī)制未能受到關(guān)注。
　　 根據(jù)傳統(tǒng)的誘導(dǎo)性中樞耐受的理論機(jī)制，如果T細(xì)胞發(fā)育過程中在胸腺內(nèi)接觸到異基因的抗原

2、，則會(huì)被誘導(dǎo)出對(duì)該異基因外周移植物的耐受，同時(shí)，血-胸腺屏障使血液中的大分子物質(zhì)包括外來抗原不能進(jìn)入胸腺，所以胸腺內(nèi)注射異基因抗原可以躲過免疫監(jiān)視，誘導(dǎo)出對(duì)異基因供體耐受的T細(xì)胞。為更好的研究異種抗原在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)特性及機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受和免疫排斥情況，我們將人肝癌細(xì)胞Hep-3B注射到10-15天的C57BL/6小鼠的胸腺中，人肝癌細(xì)胞Hep-3B作為異種不同組織的、MHC差異較大的抗原，觀察異種抗原在小鼠胸腺內(nèi)的命運(yùn)及對(duì)胸腺微環(huán)境的

3、影響。
　　 研究方法:
　　 1.胸腺內(nèi)注射異種抗原后對(duì)胸腺重量及細(xì)胞數(shù)量的影響
　　 1)Hep-3B人肝癌細(xì)胞的傳代;
　　 2)DiI染色標(biāo)記;
　　 3)小鼠胸腺內(nèi)注射細(xì)胞;
　　 4)小鼠胸腺組織稱重及胸腺細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù);
　　 2.FCM分析小鼠胸腺內(nèi)CD4CD8T細(xì)胞亞群的變化
　　 1)小鼠胸腺內(nèi)注射;
　　 2)FCM分析胸腺內(nèi)T細(xì)胞表面的CD4

4、/CD8的比例變化;
　　 3.胸腺注射異種抗原后組織切片分析
　　 1)小鼠胸腺內(nèi)注射;
　　 2)石蠟切片的制作;
　　 3)HE染色觀察;
　　 研究結(jié)果:
　　 第一部分
　　 DiI染色觀察
　　 Hep-3B人肝癌細(xì)胞在含有20微克/毫升DiI的基本培養(yǎng)基中標(biāo)記30min后，細(xì)胞標(biāo)記成功，并發(fā)射出強(qiáng)烈的紅色熒光。
　　 胸腺重量及胸腺總數(shù)的變化
　

5、　 注射之后的實(shí)驗(yàn)組的C57BL/6小鼠胸腺的重量一直持續(xù)上升，與對(duì)照組相比，14天和21天的時(shí)候，重量差距較為明顯，相對(duì)于胸腺重量的增加，7天，14天，21天的時(shí)候小鼠的胸腺細(xì)胞的數(shù)量卻減少。
　　 第二部分
　　 FCM分析小鼠胸腺內(nèi)CD4CD8 T細(xì)胞亞群的變化
　　 注射后7天和21天的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組對(duì)比，雙陽性的CD4CD8有明顯的減少，單陽性CD4和單陽性CD8、雙陰性CD4CD8均有很明顯的增高，

6、特別是單陽性的增加十分明顯，21天的對(duì)比，基本未有明顯的差別。
　　 第三部分
　　 胸腺注射異種抗原后組織切片分析
　　 組織學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)胸腺內(nèi)注射后初期，人肝癌細(xì)胞完整，一些正在進(jìn)行有絲分裂，但隨著時(shí)間的推移，人肝癌細(xì)胞Hep-3B周圍開始聚集大量的淋巴細(xì)胞，同時(shí)，一些癌細(xì)胞開始死亡，到達(dá)21天的時(shí)候，檢測(cè)不到癌細(xì)胞的存在，可以看到大量的鱗狀上皮細(xì)胞，這可能與胸腺的組織結(jié)構(gòu)重建有關(guān)。
　　 人肝癌細(xì)

7、胞在小鼠胸腺內(nèi)最終沒有逃脫免疫細(xì)胞的攻擊而發(fā)生死亡，腫瘤細(xì)胞及其殘骸可能存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)21天左右。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.注射異種抗原細(xì)胞之后，在小鼠胸腺內(nèi)被免疫細(xì)胞攻擊與清除的命運(yùn)，并確定巨噬細(xì)胞及成熟的T淋巴都參與了異種抗原的免疫攻擊及清除。
　　 2.注射異種抗原細(xì)胞，對(duì)小鼠胸腺內(nèi)T細(xì)胞發(fā)育及各類細(xì)胞亞群比例均造成一定影響，CD4 CD8雙陽性細(xì)胞比例顯著減小，CD4/CD8單陽性細(xì)胞比例有所上升，但隨