基于超抗原SEB的小鼠肺癌免疫基因治療.pdf

1、研究背景與目的:肺癌已成為人類頭號癌癥殺手。我國肺癌的患病率和死亡率仍在不斷攀升。在過去幾十年，隨著手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步，放化療治療，針對表皮生長因子(epithelial growth factor receptor，EGFR)突變的絡(luò)氨酸激酶抑制劑的使用，肺癌的治療效果有一定改善，但其總的5年生存率仍小于15％。因此，探索肺癌治療新方法仍具有迫切的現(xiàn)實意義。肺癌免疫基因治療是近年來研究的熱點之一。腫瘤免疫基因治療的重要策略之一，是通過核酸

2、分子克隆技術(shù)，將特定外源性抗原基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，使其表達(dá)外源性抗原，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，殺傷腫瘤細(xì)胞。超抗原是由細(xì)菌、病毒、寄生蟲等分泌一類小分子蛋白質(zhì)，微量抗原就能強(qiáng)烈激活免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖，同時釋放免疫細(xì)胞因子。葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)是發(fā)現(xiàn)最早、研究最廣泛的超抗原之一，其有多達(dá)幾十種亞型，諸如SEA、SEB、SEC等，SEB為最常見的亞型之一。SEs作為一類細(xì)菌性

3、外毒素，是葡萄球菌感染導(dǎo)致的各種炎性癥狀的主要原因，這些癥狀包括發(fā)熱、腹瀉以至感染性休克。不過，近年來也有研究顯示，因其強(qiáng)抗原性，SEs可能在腫瘤的免疫治療中發(fā)揮作用。然而，也有研究，SEs的強(qiáng)抗原性可以引入腫瘤細(xì)胞中并使其表達(dá)。本研究將構(gòu)建SEB基因表達(dá)載體，并研究其對Lewis肺癌荷瘤小鼠的治療作用。從而探討以SEB為目的基因的肺癌免疫基因治療的可行性和具體方法。
　　方法:1.以GenBank中SEB基因cDNA序列為模板，

4、密碼子優(yōu)化后，通過化學(xué)合成的方法獲得目的基因SEB序列，同時設(shè)計用于PCR擴(kuò)增SEB基因的引物，正向引物序列為:5'-AAGTATCTAGAGATGCCACCATG-TACAACAGACTCTTCGTCAGCC-3';反向引物::5'-GCCGAGGATCC-TCACTTCTTCTTAGTTGTCAGGTATA-3。引物的5'端分別設(shè)計有XbaⅠ(TCTAGA)、BamHⅠ(GGATCC)酶切位點。2.通過核酸分子克隆技術(shù)將SEB基因克

5、隆到質(zhì)粒PCDH-CMV-GFP中，構(gòu)建成SEB表達(dá)質(zhì)粒PCDH-SEB-GFP;并用測序方法和酶切方法進(jìn)行鑒定。3.用脂質(zhì)體將構(gòu)建的PCDH-SEB-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，并用Western Blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SEB蛋白的表達(dá)情況。4.將小鼠Lewis肺癌細(xì)胞接種到C57小鼠右側(cè)腋下（3×106個細(xì)胞/只），當(dāng)腫瘤體積約為50mm3時，將小鼠分為實驗組、陰性對照組和空白對照組，每組6只小鼠。實驗組小鼠

6、瘤內(nèi)注射PCDH-SEB-GFP質(zhì)粒，陰性對照組瘤內(nèi)注射空載質(zhì)粒PCDH-CMV-GFP，空白對照組注射等體積的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)。質(zhì)粒注射每3天一次，共3次，每次質(zhì)粒用量為20ug，脂質(zhì)體20ul，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整至100ul。每2天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，計算瘤體體積，繪制腫瘤生長曲線，最后一次質(zhì)粒注射后2天，剝出眼球采血，并處死小鼠，完整剝離腫瘤塊，測量腫瘤長徑和短徑

7、，據(jù)此計算瘤體體積，比較各組小鼠瘤體體積;用電子天平稱量腫瘤質(zhì)量，比較各組小鼠平均瘤重的差異。5.取各組小鼠腫瘤組織作常規(guī)HE染色，觀察腫瘤組織有無壞死，以及有無炎細(xì)胞浸潤;用免疫組化方法檢測腫瘤組織中SEB表達(dá)情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法檢測各組小鼠血清中細(xì)胞因子γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necros

8、is factor-α，TNF-α)的濃度。
　　結(jié)果:1、本研究合成的SEB基因長度為801bp，通過瓊脂糖凝膠電泳、基因測序鑒定，基因大小及序列與預(yù)期結(jié)果完全一致。2、成功構(gòu)建SEB基因表達(dá)質(zhì)粒，測序和酶切鑒定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。3、用脂質(zhì)體方法將PCDH-SEB-GFP和PCDH-CMV-GFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，24小時后，部分細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率約40％; Western blot實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)

9、染PCDH-SEB-GFP質(zhì)粒的Lewis肺癌細(xì)胞中有SEB蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染空載體PCDH-CMV-GFP質(zhì)粒的Lewis肺癌細(xì)胞及空白組（未轉(zhuǎn)染）無SEB蛋白表達(dá)。4、成功構(gòu)建Lewis肺癌細(xì)胞C57小鼠腫瘤模型，小鼠成瘤率100％，成瘤期間小鼠無死亡。實驗組（瘤內(nèi)注射PCDH-SEB-GFP質(zhì)粒）小鼠平均瘤體體積、瘤體質(zhì)量小于對照組，空白組小鼠瘤體總體積、質(zhì)量明顯大于其余2組。5、HE染色顯示實驗組所有小鼠腫瘤剖面見出血、壞死區(qū)，陰