胸腺B細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)和應(yīng)答中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:胸腺是機(jī)體重要的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟的場(chǎng)所。胸腺細(xì)胞經(jīng)過陽(yáng)性選擇、陰性選擇逐漸分化為成熟的T細(xì)胞，并遷移到外周免疫器官發(fā)揮功能。胸腺為T細(xì)胞發(fā)育提供了一個(gè)復(fù)雜的微環(huán)境，該微環(huán)境由胸腺基質(zhì)細(xì)胞、可溶性分子以及細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成，有序調(diào)控T細(xì)胞的發(fā)育、成熟和遷移等。近年來有少數(shù)研究工作證明，人和鼠的胸腺中均存在著少量的B細(xì)胞，其比例占到整個(gè)胸腺中所有細(xì)胞的0.1-0.5％。正常胸腺中存在著不同發(fā)育階段的B細(xì)胞，初步資

2、料顯示，胸腺中B細(xì)胞具有一定的生理功能，例如參與胸腺內(nèi)T細(xì)胞的分化發(fā)育過程。胸腺B細(xì)胞可定位于胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)的連接處，該區(qū)域被認(rèn)為是胸腺T細(xì)胞分化發(fā)育過程中陰性選擇的發(fā)生場(chǎng)所，由此研究人員認(rèn)為胸腺B細(xì)胞在T細(xì)胞的陰性選擇過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而胸腺B細(xì)胞如何參與T細(xì)胞的陰性選擇過程及影響T細(xì)胞分化、發(fā)育機(jī)制等仍不清楚。在病理狀態(tài)下，在胸腺內(nèi)可發(fā)生B細(xì)胞的浸潤(rùn)和淋巴濾泡的形成等異常表現(xiàn)，少量研究表明，胸腺B細(xì)胞的異?？赡芘c自身免疫病的發(fā)生

3、發(fā)展相關(guān)聯(lián)，但是胸腺B細(xì)胞在自身免疫病中的功能和作用機(jī)制等仍不清楚。要解答這些問題都有待于進(jìn)一步闡明胸腺中B細(xì)胞的表型、功能和起源等。因此，圍繞胸腺B細(xì)胞的亞群鑒定及胸腺B細(xì)胞亞群在免疫調(diào)節(jié)和應(yīng)答中的作用及機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　目的:
　　探究生理及自身免疫病中胸腺B細(xì)胞亞群變化及其在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和應(yīng)答中的作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1.首先，為了驗(yàn)證胸腺中是否存在B細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞進(jìn)

4、行胞膜染色，對(duì)B細(xì)胞所占比例和表型進(jìn)行分析、鑒定;
　　2.為了鑒定胸腺中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞及效應(yīng)性B細(xì)胞，分析了正常小鼠和自身免疫病系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠胸腺中B細(xì)胞;為了分析胸腺中是否存在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞，分離胸腺淋巴細(xì)胞，用LPS（10μg/ml）體外刺激后，收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行胞內(nèi)染色，分析IL-10的表達(dá)水平。在此基礎(chǔ)上，通過胞膜染色對(duì)胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞表型作進(jìn)一步分析;為了分析自身免疫病中胸腺效應(yīng)B細(xì)胞，分離胸腺淋巴細(xì)胞，

5、通過流式細(xì)胞術(shù)分析了分泌抗體的漿細(xì)胞。
　　3.為了進(jìn)一步檢測(cè)胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1 dhi）內(nèi)IL-10表達(dá)水平，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1 dhi）和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5-CD1 dlo）后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量;
　　4.為了研究胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1 dhi）體外功能，首先經(jīng)胞

6、膜染色標(biāo)記后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1 dhi)和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5-CD1dlo），并通過磁珠分選CD4+T細(xì)胞;一方面用CFSE標(biāo)記CD4+T細(xì)胞后分別與調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1dhi）和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5-CD1 dlo）體外共培養(yǎng)72h，流式檢測(cè)CD4+T細(xì)胞增殖抑制情況;另一方面，直接將CD4+T細(xì)胞與調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19

7、+CD5+CD1dhi）和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5-CD1dlo)體外共培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞，經(jīng)流式胞內(nèi)染色檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平;
　　5.為了研究胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1dhi）體內(nèi)生理功能，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分選調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1dhi）和非調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5-CD1 dlo）后，經(jīng)尾靜脈回輸給CD19cre小鼠和狼瘡小鼠，取脾、淋巴結(jié)、胸腺等免疫器

8、官和組織，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性B細(xì)胞，CD4-CD8+T細(xì)胞和CD8-CD4+T細(xì)胞等水平變化;經(jīng)眼球取血，ELISA分析外周血清中自身抗體滴度;取腎臟，4％甲醛固定后蘇木精-伊紅染色分析腎臟病理改善狀況。
　　6.為了探討狼瘡小鼠胸腺B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞分化的影響，胞膜染色標(biāo)記后流式分選胸腺B細(xì)胞，經(jīng)尾靜脈回輸給野生型小鼠，一周后處死小鼠，流式檢測(cè)ISP細(xì)胞，CD4-CD8+和CD8-CD4+T細(xì)胞等變化情況。

9、>　　7.為了研究mTOR缺失對(duì)胸腺B細(xì)胞和ISP細(xì)胞的影響，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mTOR+/-小鼠胸腺B細(xì)胞、不成熟CD8+T細(xì)胞（ISP，表型為CD3lo-CD4-CD8+）比例和數(shù)目的變化。
　　結(jié)果:
　　1.在小鼠胸腺中檢測(cè)到一定比例的B細(xì)胞，B細(xì)胞占胸腺細(xì)胞0.1％;經(jīng)Ficoll分離胸腺淋巴細(xì)胞后，B220+細(xì)胞比例提高到13.35％，CD19+細(xì)胞比例提高到4.7％，并對(duì)B細(xì)胞表型做了進(jìn)一步分析。在胸腺細(xì)胞中存

10、在IL-10+B細(xì)胞和IgG+B細(xì)胞。
　　2.在正常小鼠胸腺中存在一群表達(dá)IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1 dhi);在IL-10-GFP報(bào)告基因小鼠中也發(fā)現(xiàn)存在B220+CD5+GFP+B細(xì)胞和CD19+CD5+GFP+B細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)了胸腺中存在調(diào)節(jié)性B細(xì)胞。
　　3.調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1 dhi）可以顯著抑制CD4+T細(xì)胞增殖;其抑制T細(xì)胞的機(jī)制是通過表面CD5分子與

11、CD4+T細(xì)胞表面CD72分子間的相互作用促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　4.調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD19+CD5+）缺失的CD19cre小鼠中，胸腺CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少，CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞增加。胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+）經(jīng)尾靜脈回輸給CD19cre小鼠后，胸腺CD4+Foxp3+Tregs數(shù)目增加，CD4+CD8-T細(xì)胞和CD

12、4-CD8+T細(xì)胞減少，而且脾和淋巴結(jié)中CD4+Foxp3+ Tregs也升高。
　　5.胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1 dhi）經(jīng)尾靜脈回輸給狼瘡樣小鼠，可有效地誘導(dǎo)CD4+Foxp3+ Tregs和調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Bregs)的產(chǎn)生，從而降低外周血清中自身抗體滴度，改善腎臟病理，抑制狼瘡小鼠自身免疫反應(yīng)。
　　6.在自身免疫病條件下，例如狼瘡樣小鼠胸腺中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(表型為CD19+CD5+CD1dhi)

13、減少。同時(shí)，胸腺整體B細(xì)胞異常升高，而且主要轉(zhuǎn)變?yōu)镮gG+B細(xì)胞。
　　7.狼瘡樣小鼠胸腺中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1 dhi）減少和漿細(xì)胞（表型為lgG+）的增加可造成胸腺CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞增加。當(dāng)胸腺漿細(xì)胞缺失時(shí)，CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞減少。
　　8.對(duì)胸腺B細(xì)胞調(diào)控T細(xì)胞分化的作用機(jī)制進(jìn)行探討時(shí)發(fā)現(xiàn)，胸腺B細(xì)胞升高可以促進(jìn)不成熟CD8+T（Immat

14、ure single positive，ISP）細(xì)胞（表型為CD3lo/-CD4-CD8+）分化，進(jìn)而促進(jìn)CD4+CD8-T細(xì)胞和CD4-CD8+T細(xì)胞的分化。進(jìn)一步的研究顯示，mTOR信號(hào)參與調(diào)節(jié)ISP細(xì)胞的分化、發(fā)育。
　　結(jié)論:
　　小鼠胸腺中存在少量B細(xì)胞，在正常生理?xiàng)l件下，胸腺B細(xì)胞存在一群大量表達(dá)IL-10的調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1 dhi），它可通過細(xì)胞間的直接接觸（CD5-CD72介導(dǎo)信號(hào)

15、）誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生來維持胸腺T細(xì)胞分化、發(fā)育穩(wěn)態(tài)。在自身免疫等病理?xiàng)l件下，如狼瘡樣小鼠疾病模型中發(fā)現(xiàn)胸腺B細(xì)胞異常升高，胸腺調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（表型為CD19+CD5+CD1 dhiIL-10+B）減少，漿細(xì)胞（表型為IgG+）增加。漿細(xì)胞通過分泌IgG促進(jìn)不成熟CD8+T(Immaturesingle positive，ISP)細(xì)胞（表型為CD3lo/-CD4-CD8+）分化，進(jìn)而促進(jìn)CD4+CD8-和CD4-CD8+T細(xì)胞分化。研究