腸道菌群對腫瘤免疫微環(huán)境中抗原提呈細胞功能的影響.pdf

1、【背景】越來越多的研究證據(jù)表明，腸道菌群參與調(diào)節(jié)了機體的多種生理和疾病過程，是以往研究所忽視的一個重要“器官”。人體的腸道細菌數(shù)量達到1013級別，幾乎等同于自身體細胞的數(shù)量。由600多種共生細菌構(gòu)成的腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝狀態(tài)極容易受到飲食，抗生素等因素的影響。而腸道菌群的差異會對宿主產(chǎn)生不同的作用，從而影響到炎性腸病，糖尿病，自身免疫性疾病，甚至自閉癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展。新近的研究結(jié)果提示，一些特定的化療和免疫療法對腫瘤的治療效應(yīng)依賴

2、于完整腸道細菌的存在，提示腸道菌群和遠端腫瘤之間存在一定的聯(lián)系。雖然免疫系統(tǒng)是介導腸道菌群和腫瘤間聯(lián)系的首要考慮途徑，但是對于腸道菌群中參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的細菌或成分，以及介導腸道菌群對腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響的免疫細胞類型和具體的調(diào)節(jié)機制，現(xiàn)有研究未能提供清晰的理解。而對腸道菌群影響腫瘤免疫微環(huán)境的方式和具體機制的研究，一方面可從整體系統(tǒng)的角度為免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)機制提供新的理解，同時對以腸道菌群為靶點，開發(fā)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的新型

3、治療方式有著重要意義。
　　【目的】通過廣譜抗生素剔除小鼠腸道菌群，觀察腸道菌群缺失對小鼠抗腫瘤免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)參與介導菌群對腫瘤免疫監(jiān)視功能影響的免疫細胞類型，研究潛在菌體成分對參與介導的免疫細胞的具體影響和調(diào)控方式。
　　【實驗方法和結(jié)果】
　　1.聯(lián)合抗生素對小鼠腸道菌群的影響
　　方法：廣譜抗生素Ampicillin, Neomycin, Vancomycin聯(lián)合（ABX）飲水處理小鼠，觀察處理對小鼠

4、消化道外觀的影響，檢測抗生素處理前，處理后，撤出抗生素后小鼠糞便中細菌YCFA培養(yǎng)基培養(yǎng)后CFU數(shù)量，鱟試劑顯色法檢測血清LPS水平，16s rDNA測序分析腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性。
　　結(jié)果：ABX飲水處理可將C57BL/6小鼠腸道可培養(yǎng)細菌降低至1 CFU/100 mg以下，破壞腸道細菌的結(jié)構(gòu)，使擬桿菌門的比例大幅降低而厚壁菌門細菌比例顯著升高，同時使腸道菌群的多樣性下降，血液中的LPS濃度下降；抗生素剔除腸道細菌后盲腸外觀膨大

5、，與無菌動物類似；撤出抗生素后，腸道細菌的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、多樣性以及血液LPS水平在6天時間內(nèi)逐漸恢復，其中血液LPS水平在撤出抗生素后3天即完全恢復。
　　2.抗生素剔除菌群對小鼠抗腫瘤免疫功能的影響
　　方法：在腫瘤接種前后不同的時間段給予抗生素飲水處理：預先2周開始聯(lián)合抗生素（ABX）飲水處理至實驗結(jié)束；抗生素預先處理而接種腫瘤后停止處理（ABX-Pre）；接種腫瘤后再給予聯(lián)合抗生素的處理（ABX-Post）。與正常飲水對

6、照組比較觀察不同處理對B16F10皮下接種腫瘤生長的影響?？股仡A先處理小鼠，接種腫瘤48小時后，RT-qPCR檢測腫瘤中IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-12p35和CD80, CD86和 MHCⅡ表達水平，流式細胞術(shù)檢測腫瘤局部和脾臟中 CD11c+MHCⅡ+和CD11b+MHCⅡ+細胞比例，ELISPOT法檢測TRP2刺激后脾細胞中分泌IFN-γ細胞頻數(shù)，結(jié)晶紫染色法檢測脾細胞和脾臟NK細胞在體外對腫瘤細胞的殺傷能力

7、。
　　結(jié)果：預先聯(lián)合抗生素（ABX）飲水處理的小鼠接種腫瘤細胞后發(fā)生腫瘤的速度加快，抗生素預先處理而接種腫瘤后停止處理（ABX-Pre）的小鼠腫瘤發(fā)生速率也有加快的表現(xiàn)，而接種腫瘤后再給予聯(lián)合抗生素的處理方式（ABX-Post）不能對后續(xù)接種腫瘤的生長產(chǎn)生影響。接種后48小時，抗生素處理小鼠皮下的腫瘤中IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-12p35、CD80、CD86及MHCⅡ的mRNA水平較低?？股靥幚斫M腫瘤浸潤

8、的CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD11c+MHCⅡ+細胞和CD11b+MHCⅡ+細胞的比例均低于對照組；同時，ABX組小鼠脾臟細胞中上述細胞的比例也較低，在TRP2抗原刺激后分泌IFN-γ的細胞頻數(shù)較低，脾臟細胞和從中分離的NK細胞在體外對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)沒有發(fā)生變化。
　　3.菌體抗原補充對缺失菌群小鼠抗原提呈細胞功能的影響
　　方法：皮下荷瘤小鼠模型中腫瘤接種前給予DC注射，腫瘤注射后分別給予LPS或生理鹽水腹腔注

9、射一次；抗生素處理小鼠分別通過口服和腹腔注射途徑給予LPS，觀察記錄腫瘤生長情況。檢測不同LPS處理途徑對腫瘤局部IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-12p35 mRNA水平，CD11c+MHCⅡ+和 CD11b+MHCⅡ+細胞比例，以及腸道IL-1β、IL-6、IL-10、F4/80、CD11c、CD11b、MHCⅡmRNA水平的影響。體外培養(yǎng)骨髓來源樹突狀細胞（BMDC）和骨髓來源單核細胞（BMMo），加入LPS刺激后流

10、式細胞檢測細胞膜表面 CD80、CD86和 MHCⅡ分子的表達水平，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-12水平。將加入LPS刺激后BMDC和BMMo及未刺激的對照組細胞與T細胞共培養(yǎng)，檢測T細胞增殖和上清IL-2分泌水平。
　　結(jié)果： LPS可增強DC對小鼠皮下移植腫瘤生長的抑制。相比于腹腔注射，口服途徑補充 LPS可降低 ABX處理小鼠腫瘤瘤體大小，提高腫瘤局部 IFN-γ, TNF-α,IL-12p40，IL-12p35水平和C

11、D11c+MHCⅡ+和CD11b+MHCⅡ+細胞比例，LPS灌胃處理組小鼠腸道IL-1β因子及F4/80, CD11c, CD11b, MHCⅡ的mRNA均回復至對照水平。LPS可使體外誘導培養(yǎng)的兩種主要抗原提呈細胞BMDC和BMMo細胞膜表面的CD80和CD86表達上調(diào)，促進兩類細胞IL-12的分泌。LPS刺激后的BMMC和BMMo和T細胞共培養(yǎng)時，T細胞增殖增加，上清中IL-2水平較高。
　　【結(jié)論】聯(lián)合抗生素飲水處理可清除小