JEV疫苗突變株小鼠免疫應(yīng)答與囊膜蛋白抗原表位鑒定研究.pdf

1、日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)的囊膜蛋白(Envelopeprotein，E)由500個氨基酸組成，共有3個抗原域(Domain)，域Ⅰ、域Ⅱ、域Ⅲ。其中域Ⅲ能夠獨立的在病毒表面折疊成為免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)，與受體的結(jié)合密切相關(guān)。研究表明，EDⅢ蛋白上含有乙腦病毒的中和抗原表位，可刺激動物機體產(chǎn)生中和抗體，EDⅢ蛋白可作為檢測疫苗免疫后抗體水平的JEV抗原。
　　本研究主要利用JEV

2、EDⅢ蛋白，檢測了三個廠家的乙型腦炎弱毒疫苗株免疫小鼠后血清中JEV抗體水平的變化情況。并探索了產(chǎn)生抗體水平差異的原因;利用實驗室制備的具有中和活性的EDⅢ蛋白單克隆抗體（命名為1c4），鑒定出了一個JEV的線性表位，為今后乙型腦炎疫苗的安全、有效生產(chǎn)和新疫苗的研制提供參考依據(jù)。
　　1.不同廠家的豬乙型腦炎弱毒疫苗對小鼠免疫應(yīng)答的研究
　　通過在乳倉鼠腎細胞（BHK-21）上對三個不同廠家的豬用商品化疫苗進行空斑形成實驗，

3、發(fā)現(xiàn)不同廠家的疫苗毒株能夠在細胞上形成不同大小的空斑形態(tài)，在ICR小鼠模型上免疫這三個不同廠家的豬乙型腦炎商品化疫苗，并測定JEV抗體水平，發(fā)現(xiàn)空斑形態(tài)明顯偏小的毒株，其免疫小鼠后會產(chǎn)生較高水平的抗體應(yīng)答。對分別顯示大、小空斑的疫苗毒株進行空斑純化，得到純化的JEV弱毒株，兩個毒株的全基因組測序分析顯示空斑形態(tài)偏小的毒株具有一個在1813位的核苷酸突變，即E蛋白279位由原來的蛋氨酸(M)突變?yōu)橘嚢彼?K)。用純化的弱毒株免疫ICR小鼠

4、，測定血清中JEV抗體水平，ELISA結(jié)果顯示呈現(xiàn)小斑的毒株免疫后能產(chǎn)生更高水平的JEV抗體。說明E279位發(fā)生氨基酸突變的弱毒株對小鼠免疫后會產(chǎn)生更高水平的免疫應(yīng)答。這與先前商品化疫苗免疫小鼠后，不同廠家毒林誘使小鼠產(chǎn)生的抗體水平差異相對應(yīng)。本研究探究了E279位氨基酸突變對乙腦疫苗SA14-14-2在小鼠上免疫應(yīng)答的影響，為疫苗的生產(chǎn)和評估提供參考。
　　2.乙型腦炎病毒蛋白EDⅢ單克隆抗體的表位鑒定研究
　　根據(jù)已發(fā)表

5、的JEV EDⅢ蛋白基因序列設(shè)計引物，利用載體pGEX-6P-1構(gòu)建原核質(zhì)粒表達載體pGEX-6P-1-E1、pGEX-6P-1-E2，將EDⅢ蛋白在大腸桿菌R2中兩段表達。通過Western Blot，單克隆抗體1c4特異性識別GST-E2融合蛋白。隨后設(shè)計抗原小肽作為檢測抗原，使用ELISA方法進一步縮小1c4能夠識別的區(qū)域，同時，為精確線性表位的氨基酸序列，通過構(gòu)建原核表達載體pGEX-6P-1-R1、pGEX-6P-1-R2、p