優(yōu)化密碼沙眼衣原體主要外膜蛋白DNA疫苗免疫效果的研究.pdf

1、本研究為探索高效衣原體基因疫苗提供了新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對于新型衣原體DNA疫苗的研究具有重要意義。 一、鼠型沙眼衣原體的體外培養(yǎng)與純化及小鼠生殖道感染模型的建立 (一)、鼠型沙眼衣原體的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增與純化 我們在本實(shí)驗(yàn)室成功建立了鼠型沙眼衣原體體外培養(yǎng)與純化的方法，為后續(xù)工作奠定了基礎(chǔ)。 人宮頸癌Hela229細(xì)胞用DEAE-葡聚糖處理后，感染一定劑量的鼠型沙眼衣原體，培養(yǎng)42-48小時衣原體即在細(xì)胞內(nèi)

2、形成包涵體，完成其生活周期，擴(kuò)增產(chǎn)生大量具感染性的原體。收集衣原體感染的Hela229細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞及衣原體包涵體壁，釋放衣原體原體顆粒，經(jīng)低溫超速離心、泛影鈉一泛影葡胺密度梯度離心分離純化得到衣原體。 在實(shí)驗(yàn)過程中，我們對鼠型沙眼衣原體在hela229細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增及此后的純化的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了摸索。結(jié)果可在每175cm<'2>的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增純化得到10<'8>IFU純度較高的鼠型沙眼衣原體，從而為此后的實(shí)驗(yàn)工作打下基礎(chǔ)

3、。 (二)、鼠型沙眼衣原體生殖道感染小鼠模型的建立建立 在動物模型基礎(chǔ)上的疫苗免疫效果的評定是疫苗研究進(jìn)程中必不可缺的一步。鼠型沙眼衣原體是沙眼衣原體的鼠生物變種，以小鼠為天然宿主，有利于研究病原體與宿主間的相互作用。利用鼠型沙眼衣原體建立的小鼠生殖道感染模型在國內(nèi)外均有應(yīng)用。但根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)室報道，使用的衣原體滴度有很大差別。所以有必要在本實(shí)驗(yàn)室建立Ct小鼠生殖道感染模型，以便更準(zhǔn)確地評價疫苗的免疫效果。 本研

4、究通過陰道內(nèi)接種感染鼠型沙眼衣原體，建立Ct生殖道感染小鼠模型。通過采用不同數(shù)量的衣原體包涵體形成單位(IFU)感染小鼠，探討建立生殖道感染模型的合適感染劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用10<'5>IFU經(jīng)陰道感染6-8周齡雌性BALB/c小鼠即可造成輸卵管阻塞和輸卵管積水等并發(fā)癥。在感染后不同時間，生殖道組織出現(xiàn)不同的病理改變，主要的病理改變包括：感染早期，生殖道粘膜層水腫，粘膜層上皮細(xì)胞灶性壞死，糜爛；粘膜及粘膜下層中性粒細(xì)胞浸潤。后期以明

5、顯纖維組織增生，單核細(xì)胞浸潤粘膜及粘膜下層為主要表現(xiàn)。小鼠Ct生殖道感染模型的建立為評價Ct DNA疫苗的免疫保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。 二、肌內(nèi)免疫裸DNA疫苗比較優(yōu)化密碼和野生型MOMP DNA疫苗的免疫效果 通過優(yōu)化密碼促進(jìn)外源蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性是提高DNA疫苗免疫效果的有效途徑之一。這在某些病毒DNA疫苗的相關(guān)研究中已取得可喜進(jìn)展(如HIV、HPV等)。通過優(yōu)化密碼提高某些細(xì)菌DNA疫苗(

6、破傷風(fēng)桿菌、李斯特胞內(nèi)菌等)的免疫效果也已得到實(shí)驗(yàn)研究的證實(shí)。但目前，國內(nèi)外尚未見到衣原體優(yōu)化密碼基因疫苗的研究報道。在本課題組以往的工作中，我們首次分析比較了鼠型沙眼衣原體和人、小鼠(大鼠)等基因組偏愛密碼子的使用差異。根據(jù)人類基因密碼子使用偏好對沙眼衣原體基因進(jìn)行了優(yōu)化，自行設(shè)計合成了優(yōu)化密碼鼠型沙眼衣原體MOMP基因。并成功構(gòu)建了HuMOMP和野生型MOMP(WtMOMP)DNA疫苗。本研究在以上工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行動物免疫試驗(yàn)

7、，研究優(yōu)化密碼是否提高沙眼衣原體DNA疫苗的免疫效果；并對優(yōu)化密碼影響沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫效果的機(jī)制進(jìn)行了初步探索。 (一)、肌內(nèi)免疫優(yōu)化密碼沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫效果的研究 采用肌肉接種免疫的方式探討優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗的免疫作用。BALB/c小鼠分為四組：pcDNA3-HuMOMP免疫組、pcDNA3-WtMOMP免疫組、空載質(zhì)粒陰性對照組和滅活衣原體原體陽性對照組。 研究結(jié)

8、果發(fā)現(xiàn)： 1、HuMOMP基因免疫組小鼠的DTH平均值以及脾淋巴細(xì)胞增殖SI值均明顯高于WtMOMP基因免疫組(P<0.05)；說明優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗能增強(qiáng)免疫小鼠的特異性細(xì)胞免疫。細(xì)胞因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)HuMOMP基因免疫組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中特異性IFN-γ水平顯著高于WtMOMP基因免疫組(P<0.05)，說明優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗能明顯增強(qiáng)Th1類細(xì)胞免疫反應(yīng)。 2、小鼠血清特異性IgG抗體檢測結(jié)果表明

9、，與WtMOMP基因免疫組相比，HuMOMP基因免疫組IgG水平有所提高，體液免疫有一定程度的增強(qiáng)。但小鼠生殖道SIgA檢測在各組小鼠中均顯示為陰性結(jié)果。提示，經(jīng)肌內(nèi)途徑接種MOMP DNA疫苗未能誘導(dǎo)生殖道粘膜產(chǎn)生特異性SIgA。 3、生殖道衣原體攻擊試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載質(zhì)粒對照組相比，HuMOMP基因免疫組小鼠對衣原體生殖道的攻擊產(chǎn)生了部分保護(hù)作用，表現(xiàn)為生殖道衣原體定植減少，生殖道感染病理改變較輕。HuMOMP基因免疫組的

10、保護(hù)作用強(qiáng)于野生型MOMP基因免疫組，但兩者之間無顯著差異。 (二)、優(yōu)化密碼增強(qiáng)沙眼衣原體MOMP DNA疫苗免疫原性的機(jī)制初探 以上研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)化密碼能夠增強(qiáng)沙眼衣原體MOMP DNA疫苗的免疫效應(yīng)，但其機(jī)制如何尚不清楚。 為探討優(yōu)化密碼DNA疫苗免疫效應(yīng)的增強(qiáng)是否與抗原蛋白的表達(dá)有直接的關(guān)系，我們比較了優(yōu)化密碼與野生型MOMP基因在小鼠肌肉內(nèi)的表達(dá)水平。提取各免疫組小鼠肌肉組織總蛋白，作Western blo

11、t分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：優(yōu)化密碼基因組可見明顯。MOMP蛋白條帶(約40KD)，而野生型基因組在相應(yīng)分子量位置沒有肉眼可見的蛋白條帶，說明優(yōu)化密碼增強(qiáng)了MOMP蛋白在小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平。HuMOMP DNA疫苗免疫效果的增強(qiáng)與密碼修飾增加了MOMP蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)水平有直接關(guān)系。我們進(jìn)一步探討了優(yōu)化密碼增強(qiáng)哺乳動物細(xì)胞中衣原體蛋白表達(dá)的機(jī)制。采用熒光定量RT-PCR方法分析了HuMOMP基因和野生型MOMP基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

12、 HuMOMP和WtMOMP基因轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參照，熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，優(yōu)化密碼MOMP基因的mRNA水平僅為野生型MOMP基因的1.36倍(而我們以往的研究結(jié)果證明優(yōu)化密碼MOMP基因的蛋白表達(dá)可增強(qiáng)至少10倍以上)。說明，在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，此兩種MOMP基因在mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。這與大多數(shù)學(xué)者在優(yōu)化密碼相關(guān)研究(HPV6b E7，BPV L1等)

13、中獲得的結(jié)論相一致，即在哺乳動物細(xì)胞中，野生型基因與人源化基因在mRNA表達(dá)水平無明顯差異，但在蛋白表達(dá)水平兩者差異明顯。提示，人源化優(yōu)化密碼基因蛋白表達(dá)增加的機(jī)制可能主要在轉(zhuǎn)錄后水平。具體哪些因素在轉(zhuǎn)錄后水平影響了MOMP蛋白的表達(dá)，我們將在以后的工作中進(jìn)行深入研究。 三、粘膜免疫優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗的免疫效果和霍亂毒素B亞單位及CpG基因佐劑的增效作用 Ct感染后，細(xì)胞免疫和體液免疫共同參與針對Ct的特異性保

14、護(hù)性免疫應(yīng)答，CD4<'+>Thl細(xì)胞免疫反應(yīng)在清除Ct感染中起重要作用?？笴t MOMP SIgA的存在，減少了陰道感染率和相關(guān)的炎癥反應(yīng)，在防御Ct感染中具有明顯作用。因此安全有效的Ct疫苗應(yīng)引起Thl類反應(yīng)占優(yōu)勢的保護(hù)性細(xì)胞免疫和強(qiáng)的粘膜SIgA反應(yīng)。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1、CTB和CpG為佐劑的HuMOMP DNA疫苗免疫組小鼠(1)Ct特異性細(xì)胞免疫明顯增強(qiáng)，其中以Th1類細(xì)胞免疫占主要優(yōu)勢(IFN-γ明顯升高(

15、2037．03pg/ml)，為PBS組的136．5倍，為單獨(dú)HuMOMP免疫組的3倍；IgG2a明顯升高(OD值為0．98)，與Ct-EB陽性對照組相比無顯著差異(1．30，P>0.05)。(2)生殖道Ct特異性SIgA抗體升高(OD值為0．732)；與Ct-EB陽性對照組接近(0．88，P>0.05)。 (3)對Ct生殖道的攻擊具有較強(qiáng)免疫保護(hù)作用，甚至與Ct-EB陽性對照組的保護(hù)作用水平相當(dāng)。表現(xiàn)為Ct生殖道的定植明顯減少、清除加快

16、；感染后第12天僅有生殖道局部少量炎細(xì)胞浸潤，未造成上行感染，輸卵管、卵巢基本正常。 2、單獨(dú)優(yōu)化密碼HuMOMP DNA疫苗鼻腔接種只能誘導(dǎo)低水平的細(xì)胞免疫及體液免疫，對Ct生殖道的攻擊的保護(hù)作用較低，感染后第12天陰道、子宮粘膜下有較多炎細(xì)胞浸潤，輸卵管壁增厚，有炎細(xì)胞浸潤。 以上結(jié)果說明，CTB和CpG佐劑能夠顯著增強(qiáng)優(yōu)化密碼MOMP DNA疫苗粘膜免疫的免疫效果：免疫小鼠產(chǎn)生以Th1類占主要優(yōu)勢的特異性細(xì)胞免疫及