人乳頭瘤病毒與沙眼衣原體嵌合DNA疫苗的免疫效應(yīng)及其“Prime-boost”免疫策略的初步研究.pdf

1、目的： [1]以密碼子優(yōu)化的人乳頭瘤病毒(HPV)6b結(jié)構(gòu)蛋白L1△為載體攜帶沙眼衣原體(Ct)主要外膜蛋白多表位(MOMP168)，克隆HPV6bL1△/CtMOMP168的嵌合基因。并通過(guò)pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168，即人乳頭瘤病毒與沙眼衣原體嵌合DNA疫苗。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，篩選重組表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western

2、blot分析證實(shí)目的蛋白。 [2]提取pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168重組質(zhì)粒，溶于PBSbuffer并免疫BALB/C小鼠，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。研究pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168重組質(zhì)粒的免疫效應(yīng)。 [3]以pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168和pET32a/CtMOMP168蛋白聯(lián)合免疫對(duì)小鼠的免疫效應(yīng)，探討“Prime-boost”免疫方

3、案的最佳免疫策略。 [4]所有動(dòng)物0w，2w，4w免疫。途徑：DNA采用小鼠股四頭肌注射免疫，蛋白采用背部多點(diǎn)注射。初免后0，1，3，5，7w小鼠尾靜脈取血，檢測(cè)其體液免疫效應(yīng)，同時(shí)取小鼠陰道分泌物，檢測(cè)局部黏膜的sIgA的產(chǎn)生。并于小鼠初兔后第8周，每組處死3只小鼠，取脾淋巴細(xì)胞檢測(cè)其CTL細(xì)胞殺傷活性和胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ，IL-4，IL-10的分泌。 方法： [1]設(shè)計(jì)了擴(kuò)增HPV6bL1△的PCR引物，

4、并在兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)。同時(shí)將質(zhì)粒pET32a/HPV6bL1/CtMOMP168用相同的酶進(jìn)行酶切，通過(guò)基因克隆方法將HPV6bL1△的PCR片段定向插入到原核表達(dá)載體pET32a/HPV6bL1/CtMOMP168中，以置換HPV6bL1片段，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168；再將前者中的HPV6bL1△/CtMOMP168經(jīng)酶切連接到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)，最終構(gòu)建了真核表達(dá)重組

5、質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168。測(cè)序分析進(jìn)行鑒定。用Polyfect脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞，通過(guò)SDS-PAGE電泳和Westernblot分析鑒定表達(dá)的重組質(zhì)粒。 [2]大量提取pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/ctMOMP168重組質(zhì)粒，溶于PBSbuffer并免疫BALB/C小鼠，150ug/100ul/只，同時(shí)設(shè)置同時(shí)設(shè)置①pcDNA3.0/HPV

6、6bL1△，②pcDNA3.0/HPV6bL1③pcDNA3.1(+)/CtMOMP168，④pcDNA3.0/HPV6b1△+pcDNA3.1(+)/CtMOMP168⑤pcDNA3.1和⑥PBSbuffer等六組作為對(duì)照。共7組，每組7只小鼠。于0w，2w，4w小鼠股四頭肌免疫。所有小鼠免疫前均采用利多卡因局部注射。以使肌肉松弛，便于質(zhì)粒的吸收。 [3]核酸和蛋白聯(lián)合免疫方案“Prime-boost”。具體分3組：①pcDN

7、A3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168首次0周免疫，pET32a/CtMOMP168蛋白2、4周加強(qiáng)免疫兩次；②pET32a/CtMOMP168蛋白首次0周免疫，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP1682、4周加強(qiáng)免疫兩次：③pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168和pET32a/CtMOMP168蛋白同時(shí)0、2、4周免疫3次。 [4]初免后0，1，3，5，7周小鼠尾靜脈取血

8、，分離血清，檢測(cè)其特異性抗HPV6bL1，pET32a/CtMOMP168和抗Ct全菌體的抗體，同時(shí)用100ulPBSbuffer沖洗小鼠陰道，檢測(cè)局部黏膜sIgA的產(chǎn)生。并于小鼠初免后第8周，每組處死3只，取脾淋巴細(xì)胞檢測(cè)其CTL細(xì)胞的殺傷活性和胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ,，IL-4，IL-10的分泌情況。 結(jié)果： [l]經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，獲得了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168。

9、轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞COS-7后，通過(guò)SDS-PAGE和Westernblot分析鑒定，在真核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)了分子量約為60KDa的嵌合蛋白。 [2]動(dòng)物免疫后檢測(cè)各組小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫效應(yīng)，ELISA結(jié)果顯示核酸免疫后pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168組，能產(chǎn)生對(duì)pET32a/CtMOMP168的特異性IgG和sIgA，也能產(chǎn)生對(duì)HPV6bL1和Ct全菌體的特異性IgG。CTL細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠核酸

10、免疫后能產(chǎn)生對(duì)靶細(xì)胞的特異性殺傷作用，F(xiàn)CM檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子結(jié)果顯示，免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生較高的IFN-γ，產(chǎn)生IL-4和IL-10則相對(duì)較低。 [3]核酸和蛋白聯(lián)合免疫方案“Prime-boost”：通過(guò)檢測(cè)以上指標(biāo)并相互比較，顯示①pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168首次0周免疫，pET32a/CtMOMP168蛋白2、4周加強(qiáng)免疫兩次和③pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP

11、168和pET32a/CtMOMP168蛋白同時(shí)0、2、4周免疫3次兩種方案相對(duì)于②pET32a/CtMOMP168首次0周免疫，pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP1682、4周加強(qiáng)免疫兩次更能刺激小鼠產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。三種免疫方案中，以①③為佳。 結(jié)論： [1]成功構(gòu)建了嵌合基因真核表達(dá)質(zhì)粒，并在哺乳細(xì)胞中表達(dá)了嵌合蛋白。為研究HPV-Ct嵌合疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 [2]pcD

12、NA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168免疫小鼠后，能刺激其產(chǎn)生全身的體液免疫和細(xì)胞免疫效應(yīng)，及粘膜局部的體液免疫反應(yīng)。 [3]核酸和蛋白聯(lián)合免疫方案“Prime-boost”中，以①pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168首次0周免疫，pET32a/CtMOMP168蛋白2、4周加強(qiáng)免疫兩次和③pcDNA3.1(+)/HPV6bL1△/CtMOMP168和pET32a/CtMOMP168蛋白同