沙眼衣原體亞單位疫苗候選抗原的篩選及GlgA蛋白的生物學(xué)特性分析.pdf

1、沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）生殖道感染日趨嚴(yán)峻，目前仍缺乏有效疫苗。亞單位疫苗是衣原體疫苗發(fā)展的必然趨勢，但單一亞單位疫苗很難在Ct粘附、侵入、增殖、釋放等各階段發(fā)揮作用，在現(xiàn)有基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)和鑒定更多有效的Ct亞單位疫苗候選抗原，構(gòu)建含有多種抗原分子、多價(jià)聯(lián)合的亞單位疫苗并在佐劑、免疫接種途徑等方面進(jìn)行優(yōu)化是 Ct疫苗研究的優(yōu)選策略。本研究采用Ct小鼠生殖道感染模型對課題組前期發(fā)現(xiàn)的5個(gè)免疫優(yōu)勢抗原進(jìn)行保

2、護(hù)性評價(jià)，篩選有效的亞單位疫苗候選抗原；對文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)粒編碼蛋白Pgp3的保護(hù)性進(jìn)行評價(jià)，判斷其作為亞單位疫苗候選抗原的可行性并比較不同接種途徑對其保護(hù)性的影響；應(yīng)用“高通量融合蛋白微陣列”技術(shù)，全基因組篩選Ct感染依賴性抗原，為亞單位疫苗候選抗原提供更多的備選分子。
　　衣原體致病機(jī)制不清是阻礙疫苗成功研制的重要因素。衣原體嚴(yán)格胞內(nèi)寄生，在感染細(xì)胞的包涵體內(nèi)常有糖原合成，糖原累積障礙則Ct的致病能力隨之消失，因此，研究Ct糖原代

3、謝相關(guān)酶類物質(zhì)的定位及生物學(xué)特性，對闡明Ct糖原代謝途徑及致病機(jī)制具有重要意義，并可能對Ct疫苗設(shè)計(jì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。
　　一、 Ct免疫優(yōu)勢抗原的保護(hù)性評價(jià)及感染依賴性抗原的篩選研究目的
　　1.對課題組前期鑒定的5個(gè)免疫優(yōu)勢抗原（ArtJ，OmcB，MIP，Inc，HP）進(jìn)行動(dòng)物免疫后的保護(hù)性評價(jià)，為人類衣原體亞單位疫苗研制提供候選抗原及參考信息。
　　2.探討衣原體強(qiáng)免疫原性的質(zhì)粒編碼蛋白 Pgp3是否具有亞單位疫苗

4、的保護(hù)作用，并比較Pgp3蛋白不同免疫接種途徑對保護(hù)性效果的影響。
　　3.全基因組范圍篩選沙眼衣原體免疫優(yōu)勢的感染依賴性抗原，為Ct致病機(jī)制研究及疫苗防治提供新靶標(biāo)。
　　研究方法
　　1.利用pGEX-6p載體，原核克隆表達(dá)并純化MoPn的5個(gè)免疫優(yōu)勢抗原（ArtJ，OmcB，MIP，Inc，HP），與弗氏不完全佐劑IFA及新型佐劑CpG寡脫氧核苷酸混勻后肌肉接種免疫Balb/c小鼠，再采用MoPn EB陰道感染小

5、鼠，間接免疫熒光法檢測抗原免疫對小鼠下生殖道衣原體清除率的影響，肉眼和組織病理學(xué)染色觀察上生殖道組織的炎癥和水腫情況，ELISA法檢測特異性抗體滴度及細(xì)胞因子產(chǎn)生情況。
　　2.利用pGEX-6p載體，原核克隆表達(dá)并純化Pgp3蛋白，分別與佐劑CpG或/和IFA混勻后，經(jīng)滴鼻或肌注途徑免疫Balb/c小鼠，再采用MoPn EB陰道感染小鼠，比較Pgp3蛋白不同接種方式對小鼠下生殖道衣原體清除率和上生殖道病變的影響；比較兩種接種方式

6、誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫應(yīng)答有何不同。
　　3.制備大量高純度的Ct D型活EB及經(jīng)紫外線滅活的UV-EB，將低劑量活EB以滴鼻感染的方式免疫一組C3H/HeJ小鼠，將高劑量UV-EB與佐劑混勻后以肌肉接種的方式免疫另一組小鼠，分別收獲兩組小鼠的血清，與Ct D型全基因組編碼的“高通量融合蛋白微陣列”進(jìn)行ELISA反應(yīng)，篩選僅被活EB滴鼻感染組小鼠血清優(yōu)勢識別的感染依賴性抗原，并檢測這些抗原刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的情況。
　　

7、研究結(jié)果
　　1.以MoPn基因組DNA為模板，制備了5種較高純度的衣原體重組蛋白，肌肉接種免疫小鼠后，僅MIP蛋白誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了較強(qiáng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為下生殖道脫落上皮細(xì)胞中的衣原體含量顯著減少，清除速率加快；上生殖道的輸卵管積水程度和炎癥反應(yīng)減輕，發(fā)病率下降。MIP免疫能刺激小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性抗體和高水平的Th1型細(xì)胞因子IFN-γ。
　　2. Pgp3蛋白滴鼻或肌肉注射方式免疫小鼠，均能增強(qiáng)小鼠對衣原體下生殖道

8、感染的抵抗力，但滴鼻組小鼠陰道脫落上皮細(xì)胞中MoPn帶菌量在感染后12d與對照組比較即有顯著性差異，而肌肉組這種差異要到感染后21d才出現(xiàn)；感染后60d僅滴鼻組小鼠輸卵管積水發(fā)病率、炎癥和水腫程度顯著低于對照組，p<0.01。
　　3. Pgp3蛋白滴鼻免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的IgG亞類中IgG2a與IgG1的比值、下生殖道分泌物中IgA的含量均顯著高于Pgp3蛋白肌肉免疫組；兩種方式免疫后的小鼠脾細(xì)胞，在體外受到Pgp3蛋白的再次刺激

9、時(shí)，滴鼻組較肌注組產(chǎn)生更高水平的IFN-γ和更低水平的IL-17。
　　4. Ct低劑量活EB以滴鼻感染的方式或高劑量UV-EB以肌肉接種的方式免疫兩組 C3H/HeJ小鼠后，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體效價(jià)兩組之間無顯著性差異（p＝0.56）；Ct全基因組908個(gè)ORFs編碼的抗原，僅有60個(gè)抗原可被至少一份血清識別，其中30個(gè)抗原只被活EB滴鼻感染組小鼠血清識別；有12個(gè)抗原被兩組血清同時(shí)識別且各組的識別率均≥50％，1個(gè)抗原 CT875僅

10、被 UV-EB肌肉免疫組小鼠血清識別且識別率≥50%，5個(gè)抗原只被活 EB滴鼻感染組小鼠血清識別且識別率≥50%。
　　5.識別頻率≥40%的9種感染依賴性抗原，有7種刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ與對照組比較顯著升高（p<0.01），有8種與對照組比較顯著降低（p<0.05）。
　　結(jié)論
　　1.被評估的5種免疫優(yōu)勢抗原，僅MIP蛋白免疫可誘導(dǎo)小鼠抵抗MoPn的生殖道感染，其免疫保護(hù)機(jī)制可能與誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型為主的細(xì)胞免

11、疫應(yīng)答有關(guān)。
　　2. Pgp3蛋白滴鼻免疫較肌肉免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的Th1型免疫應(yīng)答，滴鼻方式能誘導(dǎo)小鼠抵抗MoPn的生殖道感染。
　　3. CtD型活EB滴鼻感染方式免疫或UV-EB肌注方式免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的抗體效價(jià)無差異，但有30個(gè)Ct D型基因組編碼的抗原僅被活EB滴鼻感染組小鼠產(chǎn)生的血清抗體識別，為篩選出來的感染依賴性抗原。
　　4. pCT03(Pgp3)，CT823，CT806，CT148，CT039，

12、CT315這6種感染依賴性抗原主要刺激小鼠產(chǎn)生CD4+Th1型為主、Th17型減低的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　二、 Ct糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)的定位及 GlgA蛋白的生物學(xué)特性研究
　　研究目的
　　1.對Ct6個(gè)糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)在衣原體感染細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)行定位分析，為研究Ct的糖原代謝途徑提供有力的實(shí)驗(yàn)工具和數(shù)據(jù)。
　　2.研究Ct糖原合酶GlgA蛋白的分泌特點(diǎn)及對細(xì)胞糖原濃度和衣原體感染的影響，分析人類Ct自然感染

13、情況下GlgA蛋白的免疫原性，為深入探討GlgA蛋白的功能及在衣原體致病機(jī)制中的作用打下基礎(chǔ)。
　　研究方法
　　1.從Ct D型基因組獲取糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)的編碼基因——CT042(GlgX)，CT087(MalQ)，CT248(GlgP),CT295(MrsA)，CT489(GlgC)，CT798(GlgA)，原核克隆表達(dá)并純化后免疫小鼠制備相應(yīng)的多克隆抗體，間接免疫熒光法檢測其在Ct感染細(xì)胞的定位；抗體稀釋法、免疫熒

14、光共聚焦顯微鏡、GST融合蛋白吸附實(shí)驗(yàn)及Western Blot技術(shù)等分析GlgA多克隆抗體的特異性及GlgA蛋白胞漿分泌現(xiàn)象的真實(shí)性。
　　2.分段提取衣原體感染細(xì)胞的各種成分，Western Blot分析GlgA蛋白在衣原體感染細(xì)胞各成分的分布；間接免疫熒光染色法比較GlgA與CPAF蛋白分泌時(shí)相及分泌程度上的差異，研究GlgA蛋白分泌現(xiàn)象在沙眼衣原體各生物型或血清型的普遍性；構(gòu)建pGLAG-GlgA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Hela

15、細(xì)胞，研究GlgA蛋白的生物學(xué)活性，分析pFLAG-GlgA轉(zhuǎn)染對衣原體感染率的影響；收集Ct泌尿生殖道急性和慢性感染的病人血清分析人類衣原體自然感染情況下GlgA蛋白的免疫原性。
　　研究結(jié)果
　　1. Ct6種糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)均具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性抗體；用6種多抗對 Ct體外感染的Hela細(xì)胞進(jìn)行染色，僅GlgA抗體可在衣原體菌體外檢測到抗原信號，稀釋GlgA抗體僅降低染色的強(qiáng)度，不影響染

16、色信號的分布；共聚焦顯微鏡下，Ct菌體抗原主要外膜蛋白(MOMP)與另一種菌體抗原HSP60的染色信號完全重疊，而GlgA抗原與MOMP僅部分重疊，在包涵體內(nèi)菌體的間隙之間以及宿主細(xì)胞胞漿均有GlgA抗原分布。
　　2. GlgA抗體對Ct感染細(xì)胞的染色僅能被GST-GlgA融合蛋白移除，GST-CPAF或GST-Pgp3融合蛋白的預(yù)吸附對GlgA抗體的染色沒有影響，反之亦然；在Western Blot的檢測中，3種分泌蛋白Glg

17、A、CPAF和Pgp3的相應(yīng)抗體也只識別相應(yīng)的內(nèi)源性抗原及各自的GST-融合蛋白。
　　3. GlgA抗原在衣原體感染細(xì)胞的胞漿、包涵體、EB、RB廣泛分布，與CPAF僅分布與感染細(xì)胞胞漿的存在模式明顯不同；GlgA蛋白在衣原體感染細(xì)胞后12h開始表達(dá)于包涵體，感染后24h分泌到宿主細(xì)胞胞漿，同時(shí)在包涵體內(nèi)仍有分布，并一直持續(xù)到感染結(jié)束；GlgA蛋白在Ct體外感染細(xì)胞的分布率與CPAF一致，其分泌現(xiàn)象普遍存在于Ct各生物型/血清型

18、。
　　4.外源pFLAG-CMV4-GlgA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞后，能顯著提高細(xì)胞的糖原濃度但不影響細(xì)胞對衣原體的感染；GlgA蛋白能被生殖道Ct感染的女性患者血清識別，其中STI患者（Ct急性感染）的識別率為60%，TFI患者（Ct慢性感染）的識別率為29%，兩組之間有顯著性差異；其它3種分泌性蛋白CPAF、Pgp3、CT795被STI或TFI血清識別率為100%、95%、35%或92%、96%、50%，兩組無明顯差異。

19、>　　結(jié)論
　　1.首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí) Ct糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì) CT798(糖原合酶，GlgA)是一種胞漿分泌蛋白，與 Ct其它兩種分泌蛋白 CPAF和Pgp3之間無交叉反應(yīng)。
　　2.Ct其它5種糖原代謝相關(guān)酶類物質(zhì)CT042(GlgX)，CT087(MalQ)，CT248(GlgP)，CT295(MrsA)，CT489(GlgC)均定位于衣原體菌體。
　　3.糖原合酶GlgA蛋白的分泌特性與胞漿分泌蛋白CPAF相似但