沙眼衣原體感染體液免疫應(yīng)答譜的建立及Tarp蛋白生物學(xué)特性的研究.pdf

1、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，簡稱Ct)是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原核微生物，為臨床上導(dǎo)致失明的主要病因之一，亦是性傳播性疾病(sex transmitted disease，STD)最常見的病原體，Ct感染生殖道后亦可增加HIV傳播的危險性及宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)病率。雖然沙眼衣原體感染可以用抗生素治療，但由于感染后癥狀常不明顯，甚至沒有自覺癥狀，因而很容易被忽視，其診斷和治療往往被延誤，造成Ct在宿主體內(nèi)持續(xù)存在引

2、起盆腔炎和不孕等多種并發(fā)癥。接種疫苗將是預(yù)防和控制衣原體感染性疾病最為有效的方式。由于滅活疫苗不能給沙眼患者提供保護(hù)性作用，近十年來，大家主要致力于研究衣原體亞單位疫苗，但由于對衣原體保護(hù)性和致病性因子知識的缺乏，至今仍未有成熟的衣原體疫苗問世。從全基因組范圍分析衣原體性蛋白所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，尋找Ct免疫優(yōu)勢抗原，將有助于篩選衣原體毒力相關(guān)因子和保護(hù)性蛋白，闡明Ct的致病機(jī)制，促進(jìn)衣原體診斷試劑盒及疫苗的研制。
　　 一、沙眼衣

3、原體感染人體后體液免疫應(yīng)答譜的建立
　　 研究目的：
　　 1.克隆表達(dá)D型Ct全基因組ORFs編碼蛋白的GST融合蛋白，為Ct蛋白質(zhì)組學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 2.建立Ct感染人體后體液免疫應(yīng)答譜，篩選衣原體免疫優(yōu)勢抗原；比較活沙眼衣原體感染及死衣原體接種后抗血清的抗原識別譜，篩選衣原體感染依賴性抗原，為進(jìn)一步闡明Ct感染的致病機(jī)制，Ct血清診斷試劑盒的開發(fā)及疫苗的研制提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：<

4、br>　　 1.依據(jù)文獻(xiàn)和互聯(lián)網(wǎng)http：//stdgen.northwestern.edu/對D型Ct全基因組ORFs進(jìn)行分析，給預(yù)測的918個衣原體基因或基因片段分別設(shè)計特異性引物，采用PCR方法從D型Ct基因組中擴(kuò)增獲取目的基因。構(gòu)建pGEX-6p-CTs原核表達(dá)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1blue，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組GST-CTs融合蛋白，建立D型Ct蛋白質(zhì)組。
　　 2.將衣原體蛋白質(zhì)組的全部融合蛋白按照ORFs

5、順序分裝到10塊96孔微量凹孔板中，建立衣原體全基因組蛋白質(zhì)陣列。收集Ct生殖道感染女性患者血清，應(yīng)用ELISA法檢測這些抗血清與衣原體全基因組蛋白質(zhì)陣列的免疫反應(yīng)性，建立沙眼衣原體感染人體后的體液免疫應(yīng)答譜，并篩選出衣原體的免疫優(yōu)勢抗原。
　　 3.為鑒定衣原體性蛋白與抗血清反應(yīng)的特異性：①應(yīng)用衣原體感染的HeLa細(xì)胞或未感染的HeLa細(xì)胞裂解物吸附抗血清，同時收集健康人血清，ELISA法分別檢測這些血清與衣原體全基因組蛋白質(zhì)

6、陣列的免疫反應(yīng)性；②Western blot法檢測ELISA法中反應(yīng)陽性的抗原與該抗血清的免疫反應(yīng)性；③免疫共沉淀結(jié)合Western blot法檢測抗血清能否從衣原體感染的HeLa細(xì)胞裂解物中沉淀出相應(yīng)衣原體性蛋白。
　　 4.分別應(yīng)用死衣原體皮下接種新西蘭大白兔，腹腔注射接種Balb/c鼠：活衣原體滴鼻感染Balb/c鼠，陰道感染Balb/c鼠及C57BL/6鼠。收集血清，ELISA法分別檢測這些抗血清與衣原體全基因組蛋白質(zhì)陣

7、列的免疫反應(yīng)性。①通過比較人類抗血清與兔、小鼠抗血清所識別的衣原體抗原譜，分析兔和小鼠是否適合用作制備抗衣原體性蛋白的抗體和篩選衣原體疫苗效果的動物模型；②通過比較活衣原體感染人類及死衣原體接種的動物抗血清所識別的衣原體抗原譜，鑒定衣原體感染依賴性抗原和感染非依賴性抗原。
　　 5.Western blot法分析衣原體感染依賴性抗原和感染非依賴性抗原在衣原體感染細(xì)胞裂解物和純化的衣原體EB、RB上的表達(dá)情況。
　　 研究

8、結(jié)果：
　　 1.分析得出目前全世界所預(yù)測的D型Ct基因組有918個ORFs，包括910個基因組編碼基因和8個質(zhì)粒編碼基因。本實驗成功克隆表達(dá)了908個基因的全長或片段，其中，788個ORFs克隆表達(dá)了全長基因，120個ORFs克隆表達(dá)了基因片段，共獲得933個pGEX-6p-CTs原核表達(dá)質(zhì)粒，并均在E.coli XL1-Blue中表達(dá)出相應(yīng)的重組融合蛋白。尚有10個ORFs未能成功誘導(dǎo)表達(dá)出高質(zhì)量的融合蛋白。它們分別是CT0

9、81，CT219，CT267，CT786，CT039.1，CT221.1，CT480.1，CT814.1，DEG02和DEG06。
　　 2.將衣原體蛋白質(zhì)組的全部GST融合蛋白按照順序分裝到10塊96孔微量凹孔板中，每一塊板中均有一CPAF陽性對照孔和一GST-alone陰性對照孔，建立了衣原體全基因組蛋白質(zhì)陣列。
　　 3.收集了99份Ct生殖道感染女性患者血清，應(yīng)用ELISA法檢測這些抗血清與衣原體全基因組蛋白質(zhì)陣

10、列的免疫反應(yīng)性，建立了沙眼衣原體感染人體后的體液免疫應(yīng)答譜，并篩選出27個衣原體免疫優(yōu)勢抗原。
　　 其中，719個衣原體抗原被99份抗血清中的一份或一份以上抗血清識別，124個抗原能被10％或10％以上抗血清識別，75個抗原能被20％或20％以上抗血清識別，50個抗原能被30％或30％以上抗血清識別，38個抗原能被40％或40％以上抗血清識別。27個抗原能被50％或50％以上抗血清識別，我們把它定義為衣原體的免疫優(yōu)勢抗原。這2

11、7個衣原體免疫優(yōu)勢抗原包括了衣原體膜蛋白：CT681，CT443，CT812；ABC轉(zhuǎn)運子蛋白CT067和CT381；包涵體膜蛋白CT119，CT147，CT442，CT529和CT813；分泌到宿主細(xì)胞漿的分泌型蛋白CT858和pCT03(Pgp3)；Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白CT089和CT456；與代謝有關(guān)的酶及蛋白酶CT240，CT798，CT806，CT828和CT841；一些衣原體hypothetical蛋白CT143，CT101

12、，CT694，CT142，CT695，CT875，CT795，CT022。其中11個抗原已經(jīng)被報道為免疫優(yōu)勢抗原，尚有16個衣原體免疫優(yōu)勢抗原為全球首次報道，分別是：CT022，CT067，CT101，CT142，CT143，CT240，CT381，CT442，CT443，CT456，CT695，CT798，CT806，CT828，CT841和CT875。
　　 4.應(yīng)用衣原體感染的HeLa細(xì)胞或未感染的HeLa細(xì)胞裂解物吸附抗

13、血清，ELISA法分別檢測這些血清與衣原體全基因組蛋白質(zhì)陣列的免疫反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用衣原體感染的HeLa細(xì)胞裂解物吸附免疫血清后，該血清不再識別Ct全基因組蛋白質(zhì)陣列，而未感染的HeLa細(xì)胞裂解物吸附抗血清后其與Ct全基因組蛋白質(zhì)陣列的反應(yīng)性與吸附之前相似。健康人血清亦不與Ct全基因組蛋白質(zhì)陣列發(fā)生反應(yīng)。結(jié)果提示：衣原體感染患者抗血清與衣原體全基因組蛋白質(zhì)陣列的反應(yīng)是抗原抗體特異性反應(yīng)。
　　 5.Western blot法檢測E

14、LISA法中反應(yīng)陽性的抗原與抗血清的免疫反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)抗原Western blot法檢測仍然為反應(yīng)陽性，少數(shù)抗原雖在ELISA法檢測時反應(yīng)陽性，但在Western blot法檢測時卻為反應(yīng)陰性。免疫共沉淀實驗結(jié)果顯示該抗血清能將ELISA法檢測陽性而Western blot法檢測陰性的蛋白從感染的：HeLa細(xì)胞裂解物中沉淀下來，從而證實該抗原是構(gòu)像依賴性抗原。該結(jié)果表明本實驗中用到的Ct全基因組蛋白質(zhì)陣列結(jié)合ELISA法檢測衣原體抗

15、原組既能檢測線性抗原，還能鑒定構(gòu)像依賴性抗原，因此該方法優(yōu)于Western blot法。27個衣原體免疫優(yōu)勢抗原中共有10個為構(gòu)像依賴性抗原，分別是：GST-CT022，GST-CT067，GST-CT101，GST-CT142，GST-CT240，GST-CT695C，GST-CT798C，GST-CT806，GST-CT828和GST-pCT03(Pgp3)。
　　 6.①通過比較人、兔和小鼠三個種屬所識別的衣原體抗原，發(fā)現(xiàn)

16、許多人類優(yōu)勢識別的抗原亦能被2種嚙齒目動物強烈識別，表明嚙齒目動物可以被用于研究衣原體引起的免疫反應(yīng)和評估衣原體疫苗候選抗原的保護(hù)作用。②比較活衣原體感染的Balb/c鼠和C57BL/6鼠識別衣原體抗原的數(shù)目，發(fā)現(xiàn)滴鼻感染和陰道感染的Balb/c鼠均識別54個衣原體抗原，而陰道感染的C57鼠僅能識別27個抗原，死衣原體接種的Balb/c鼠識別29個抗原，提示宿主識別的抗原數(shù)與感染的嚴(yán)重程度正相關(guān)。③活衣原體感染個體所識別的抗原與滅活衣原

17、體接種個體抗血清所識別的抗原差別尤為顯著。人類抗血清識別的719個抗原中，563個抗原不能被死衣原體接種的兔或鼠抗血清識別，為感染依賴性抗原；156個抗原能被死衣原體接種的兔或鼠血清識別，為感染非依賴性抗原。
　　 7.Western blot法分析衣原體感染依賴性抗原和感染非依賴性抗原在衣原體感染細(xì)胞裂解物和純化的衣原體EB、RB上的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)感染依賴性抗原主要表達(dá)在感染細(xì)胞裂解物中，而在EB上表達(dá)很少，提示這些蛋白

18、可能為分泌性蛋白，RB合成該蛋白后很快將其分泌至包涵體腔或宿主細(xì)胞漿。
　　 結(jié)論：
　　 1.D型Ct全基因組共預(yù)測有918個ORFs。
　　 2.成功地將788個Ct基因的全長和120個Ct基因的片段克隆到pGEX-6p載體中，構(gòu)建了933個pGEX-6p-CTs原核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 3.成功表達(dá)了908個衣原體基因全長或片段，制備了933個重組GST-CTs融合蛋白，建立了D型Ct蛋白質(zhì)組。并建立了

19、D型Ct全基因組蛋白質(zhì)陣列。
　　 4.建立了Ct生殖道感染女性患者中衣原體B細(xì)胞抗原組，成功建立了沙眼衣原體感染后體液免疫應(yīng)答譜，鑒定出Ct27個免疫優(yōu)勢抗原，全球首次報道16個新的衣原體免疫優(yōu)勢抗原，分別是：CT022，CT067，CT101，CT142，CT143，CT240，CT381，CT442，CT443，CT456，CT695，CT798，CT806，CT828，CT841和CT875。
　　 5.Ct全基

20、因組蛋白質(zhì)陣列結(jié)合ELISA法檢測衣原體抗原組既能檢測線性抗原，還能鑒定構(gòu)像依賴性抗原。27個衣原體免疫優(yōu)勢抗原中有10個為構(gòu)像依賴性抗原，分別是：GST-CT022，GST-CT067，GST-CT101，GST-CT142，GST-CT240，GST-CT695C，GST-CT798C，GST-CT806，GST-CT828 and GST-pCT03(Pgp3)。
　　 6.首次系統(tǒng)的鑒定出563個Ct感染依賴性抗原。在3

21、8個能被40％或40％以上患者血清識別的衣原體抗原中，共有14個衣原體感染依賴性抗原，分別是：CT089，CT116，CT142，CT153，CT228，CT442，CT529，CT694，CT798，CT806，CT813，CT828，CT858，CT866。
　　 二、沙眼衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Tarp生物學(xué)特性的研究
　　 研究目標(biāo)：
　　 1.進(jìn)一步分析衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白與沙眼衣原體生殖道感染

22、患者(sexually transmitted infection，簡稱STI)患者和沙眼患者抗血清的免疫反應(yīng)性。
　　 2.制備抗Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Tarp(CT456)的單克隆抗體。
　　 3.研究Tarp蛋白在衣原體感染HeLa細(xì)胞中的表達(dá)特征。
　　 4.評估Tarp蛋白重組疫苗的免疫保護(hù)效果。
　　 5.鑒定Tarp蛋白的免疫優(yōu)勢區(qū)。
　　 研究方法：
　　 1.通過互聯(lián)網(wǎng)搜索

23、目前已報道的CtⅢ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白。
　　 2.收集8份沙眼和24份Ct生殖道感染患者血清，ELISA法進(jìn)一步分析CtⅢ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白的免疫反應(yīng)性。應(yīng)用衣原體感染的HeLa細(xì)胞或未感染的HeLa細(xì)胞裂解物吸附抗血清，同時收集健康人血清，ELISA法分別檢測這些血清與衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白的免疫反應(yīng)性以鑒定衣原體性蛋白與抗血清反應(yīng)的特異性。
　　 3.采用雜交瘤技術(shù)制備抗Tarp蛋白的單克隆抗體，間接免疫熒光法篩

24、選陽性克隆，ELISA法鑒定單克隆抗體的特異性，間接免疫熒光法鑒定單克隆抗體的亞類和衣原體種屬特異性。
　　 4.間接免疫熒光法檢測Tarp蛋白在衣原體感染HeLa細(xì)胞中的表達(dá)特征。Western blot法檢測Tarp蛋白在純化的EB、RB、D型Ct感染的HeLa細(xì)胞裂解液中的表達(dá)。
　　 5.Tarp蛋白重組疫苗免疫保護(hù)效果的評估：
　　 ①克隆表達(dá)Ct鼠肺炎型(MoPn)Tarp同源體(TC0741)GST

25、融合蛋白，用PreScissionTM蛋白酶酶切去除GST而獲得純的TC0741重組蛋白；
　　 ②建立Balb/c小鼠MoPn生殖道感染模型，分別收集感染小鼠血清和脾細(xì)胞，ELISA法檢測內(nèi)源性Tarp蛋白誘導(dǎo)的特異性抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。
　　 ③TC0741重組蛋白免疫小鼠，分別收集小鼠血清和脾細(xì)胞，ELISA法檢測外源性Tarp蛋白誘導(dǎo)的特異性抗體的滴度及抗體亞類，間接免疫熒光法檢測抗體的特異性；ELISA法檢測Mo

26、Pn刺激脾細(xì)胞后培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4和IL-5的水平。
　　 ④以TC0741重組蛋白為免疫原，結(jié)合CPG和不完全弗氏佐劑(IFA)，采用肌肉注射方式接種Balb/c小鼠，同時設(shè)MoPn+CPG+IFA陽性對照組和單純的CPG+IFA陰性對照組，再以MoPn生殖道攻擊小鼠，間接免疫熒光法檢測小鼠陰道分泌物中MoPn的IFU值以判斷小鼠清除MoPn感染的速度：解剖分離小鼠生殖道組織，H&E(蘇木精和曙紅)染色法檢測小鼠上

27、生殖道組織病理學(xué)變化。
　　 6.克隆表達(dá)D型Ct Tarp蛋白11個片段的GST融合蛋白，ELISA法檢測這11個片段與Ct生殖道感染患者、沙眼患者、兔免疫血清，以及抗Tarp單克隆抗體的免疫反應(yīng)性，進(jìn)一步鑒定Tarp蛋白的免疫優(yōu)勢區(qū)，為進(jìn)一步探討Tarp的生物學(xué)功能和保護(hù)性作用提供實驗依據(jù)。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.通過互聯(lián)網(wǎng)搜索，目前已報道的衣原體Ⅲ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白主要有Inc家族蛋白及另外約49個衣

28、原體蛋白。應(yīng)用ELISA法檢測CtⅢ型分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白的免疫反應(yīng)性，結(jié)果顯示STI患者和沙眼患者血清均能優(yōu)勢識別D型Ct CT456(Tarp)、CT089和CT858重組蛋白，其中Tarp蛋白在沙眼患者血清中識別頻率更高達(dá)100％，其識別頻率和平均OD均高于其他蛋白，甚至高于CPAF。盡管D型Ct Inc家族免疫優(yōu)勢蛋白CT119，CT529，CT813和主要外膜蛋白MOMP能被STI患者血清優(yōu)勢識別，但在沙眼患者血清中的識別頻率卻顯

29、著低于STI患者血清。
　　 2.采用雜交瘤技術(shù)獲得9株穩(wěn)定分泌抗Tarp蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為：R4D5，N5B11，R586.2，R2H1.2，R12B12，R2H7，RSG8.1，R8G7.2和M4F4。9個mAbs全部為IgG，R5B6.2和R8G7.2為IgG2a，R4D5.K2H1.2，K12B12，R2H7，N5B11，M4F4和R5G8.1均為IgG1。間接免疫熒光法染色結(jié)果顯示9個mAbs均能

30、特異性的著色Ct血清型A、D、L2，而不著色MoPn、6BC和AR39。
　　 3.間接免疫熒光法檢測Tarp蛋白在衣原體感染HeLa細(xì)胞上的表達(dá)特征，結(jié)果顯示：在衣原體感染后8h內(nèi)可見Tarp表達(dá)，在13h時Tarp表達(dá)消失。24h衣原體包涵體己經(jīng)非常明顯，但仍不能檢測到Tarp的表達(dá)。直到28h時重新檢測到少量Tarp，而且Tarp的表達(dá)量隨感染時間的進(jìn)一步延長而逐漸增加。Western blot法檢測Tarp蛋白在純化的E

31、B、RB、HeLa-D裂解液中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tarp主要在純化的EB和HeLa-D裂解液中表達(dá)，而在RB上則不表達(dá)。結(jié)果提示Tarp蛋白是一個衣原體EB相關(guān)蛋白。
　　 4.以MoPn基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到了TC0741基因全長片段，構(gòu)建了pGEX-6p-TC0741重組質(zhì)粒；成功表達(dá)了GST-TC0741融合蛋白；用PreScissionTM蛋白酶酶切去除GST而獲得了純的TC0741重組蛋白。
　　 5.MoPn

32、感染小鼠血清中產(chǎn)生了高滴度的抗MoPn和抗Tarp的特異性抗體，該血清能識別MoPn抗原和GST-Tarp融合蛋白，但不能識別單純的GST蛋白。MoPn感染小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)Tarp蛋白和MoPn刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生了高濃度的IFN-γ，且IFN-γ的濃度隨著Tarp蛋白劑量加大而增高，而GST蛋白卻不能刺激感染小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ。各組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中基本檢測不到IL-4和IL-5的產(chǎn)生。結(jié)果提示MoPn感染小鼠后內(nèi)源性Tarp誘導(dǎo)產(chǎn)生了

33、Tarp特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　 6.給小鼠接種Tarp蛋白+佐劑以評估外源性Tarp蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。間接免疫熒光實驗檢測發(fā)現(xiàn)接種MoPn+佐劑和Tarp蛋白+佐劑的小鼠抗血清能使MoPn包涵體染色，而僅接種佐劑的小鼠抗血清卻不能使MoPn包涵體染色。MoPn感染HeLa細(xì)胞的裂解物能中和MoPn+佐劑組和Tarp蛋白+佐劑組小鼠免疫血清中抗MoPn抗體，經(jīng)預(yù)吸附后，兩組血清均不再使MoPn包涵體染色。GST-Tar

34、p蛋白預(yù)吸附Tarp蛋白+佐劑組血清后，該血清不再染色MoPn包涵體，但GST-Tarp蛋白預(yù)吸附：MoPn+佐劑組血清后，該血清仍繼續(xù)染色MoPn包涵體。ELISA法檢測小鼠免疫血清中抗MoPn特異性抗體的滴度和亞類。MoPn+佐劑組和Tarp蛋白+佐劑組小鼠抗血清中產(chǎn)生了高滴度的抗MoPn抗體，而單純佐劑組血清中則沒有抗MoPn抗體產(chǎn)生。MoPn+佐劑組和Tarp蛋白+佐劑組小鼠抗血清中IgG2a的滴度均高于IgG1，即IgG2a/

35、IgG1>1。MoPn+佐劑和Tarp蛋白+佐劑組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的濃度顯著高于單純佐劑組。各組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中基本檢測不到IL-4和IL-5的產(chǎn)生。結(jié)果提示Tarp重組疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生MoPn特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，以Th1細(xì)胞應(yīng)答為主。
　　 7.間接免疫熒光法檢測小鼠陰道分泌物中MoPn的IFU值以判斷小鼠清除MoPn感染的速度，發(fā)現(xiàn)單純接種佐劑組中，在感染后27天陰道分泌物中仍可檢測到衣原體。Mo

36、Pn+佐劑組在感染后第6天，小鼠陰道分泌物中MoPn的IFU值顯著低于單純接種佐劑組和Tarp+佐劑組(P<0.05)，第15天已基本檢測不到MoPn。Tarp+佐劑組在感染后第21天，小鼠陰道分泌物中MoPn的數(shù)量顯著低于單純接種佐劑組(P<0.05)，第24天已完全檢測不到MoPn，提示此時Tarp+佐劑組小鼠生殖道中MoPn已被完全清除。結(jié)果表明：Tarp重組疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)有利于小鼠生殖道內(nèi)衣原體感染的清除。
　　

37、 8.小鼠生殖道組織大體觀察發(fā)現(xiàn)Tarp+佐劑組(P<0.05)和MoPn+佐劑組(P<0.01)輸卵管雙側(cè)積水的發(fā)生率均顯著小于單純佐劑組。小鼠生殖道組織切片H&E染色評估炎癥的嚴(yán)重程度和生殖道管腔擴(kuò)張程度結(jié)果顯示：三組中小鼠子宮角組織的炎癥積分和管腔擴(kuò)張積分情況沒有顯著差異(P>0.05)，而在輸卵管部位，Tarp+佐劑組和MoPn+佐劑組的炎癥積分和管腔擴(kuò)張積分均顯著低于單純佐劑接種組(P<0.01)。結(jié)果提示Tarp重組疫苗能防

38、止小鼠上生殖道的炎性病理改變，具有顯著的保護(hù)作用，因此，Tarp是一個有前景的衣原體疫苗候選抗原。
　　 9.成功克隆表達(dá)了11個Tarp片段的GST融合蛋白。ELISA法檢測這11個片段與Ct生殖道感染患者、沙眼患者、兔免疫血清，以及抗Tarp單克隆抗體的免疫反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)所有Tarp反應(yīng)陽性抗血清均能識別氨基酸從152～302的區(qū)域；STI抗血清和兔抗血清能同時識別氨基酸1～156、310～431和582～682區(qū)域；只能被S

39、TI抗血清識別的是氨基酸從425～581區(qū)域；只能被兔抗血清識別的是氨基酸683～847區(qū)域。6個抗Tarp單克隆抗體識別氨基酸152～302的區(qū)域，另3個單克隆抗體分別識別氨基酸1～119、120～151，和310～431的區(qū)域。
　　 結(jié)論：
　　 1.Tarp蛋白在STI患者和沙眼患者中均為免疫優(yōu)勢抗原。
　　 2.成功建立了9株穩(wěn)定分泌抗Tarp蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
　　 3.Tarp是