乙型肝炎疫苗聯(lián)合B7-H1蛋白疫苗對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抗HBsAg免疫應(yīng)答的影響.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過(guò)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV），其中3.5億人為慢性HBV感染者。乙型肝炎及其導(dǎo)致的失代償性肝硬化、重型肝炎和肝細(xì)胞癌等終末期肝病不僅危害全人類的健康，而且也是當(dāng)前危害中國(guó)人民生命健康的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。雖然經(jīng)過(guò)各國(guó)科學(xué)家的長(zhǎng)期努力，已初步闡明HBV的持續(xù)復(fù)制和機(jī)體抗HBV免疫反應(yīng)的低下是乙型肝炎慢性化的基本原因，并且研發(fā)了若干有一定療效的治療藥物和方法，但是距離治

2、愈和徹底戰(zhàn)勝乙肝肝炎仍有相當(dāng)長(zhǎng)的路要走，進(jìn)一步深入研究和探索各種治療慢性乙型肝炎的新藥物和新方法，仍然是中國(guó)和全球科學(xué)家及醫(yī)務(wù)工作者面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)和當(dāng)務(wù)之急。
　　程序性死亡因子1及其配體1（programmed death1,PD-1;programmed death1 ligant1,PD-L1）是近年發(fā)現(xiàn)的重要的免疫調(diào)節(jié)分子，也是當(dāng)前乙型肝炎免疫發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。PD-1屬于免疫球蛋白超家族成員，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，以單

3、體形式存在，可介導(dǎo)負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)且在T、B淋巴細(xì)胞中都有表達(dá)。PD-L1又稱B7-H1（B7 homolog1）是Dong等人發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)B7家族的成員，也屬于Ⅰ型跨膜蛋白，在肝臟的抗原提呈細(xì)胞和星形細(xì)胞上均有表達(dá)。
　　PD-1/B7-H1信號(hào)通路能夠負(fù)性調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)，參與免疫耐受，使病毒特異性T細(xì)胞的免疫功能受到抑制，通常在病毒感染發(fā)生時(shí)PD-1及B7-H1的表達(dá)上調(diào)。PD-1/B7-H1信號(hào)通路是HBV逃避免疫

4、監(jiān)視、引發(fā)慢性HBV感染的重要通路，可能成為慢性HBV感染的有效治療靶位。有報(bào)道HBV轉(zhuǎn)基因小鼠（Tg鼠）處于對(duì)HBV的免疫耐受狀態(tài)，對(duì)各種HBV抗原和HBV感染均不產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，以上特點(diǎn)與某些慢性HBV感染者類似。因此，本課題引進(jìn)HBV-Tg小鼠模型，應(yīng)用第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生物制藥學(xué)教研室制備的重組人B7-H1蛋白疫苗，擬通過(guò)主動(dòng)免疫誘生HBV轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生抗B7-H1的抗體，以阻斷PD-1/B7-H1信號(hào)通路和上調(diào)抗HBV

5、免疫應(yīng)答、加速HBV的清除、減緩和阻止乙型肝炎慢性化，為探索慢性乙型肝炎的治療新方法提供理論依據(jù)。
　　本課題主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、用不同劑量的乙型肝炎疫苗和B7-H1蛋白疫苗分別于0周、2周、4周、8周共4次聯(lián)合免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，于1周、3周、5周、7周、9周、11周、13周眶后取血7次，分離血清凍存于-20℃。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)血清抗B7-H1抗體滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5周起血清中即能測(cè)到

6、 B7-H1抗體，且同一時(shí)間點(diǎn)各組之間的抗體滴度值并無(wú)明顯差異。
　　2、在免疫后第14周末處死小鼠取脾細(xì)胞，檢測(cè)不同的免疫方法對(duì)HBsAg特異性分泌IFN-γT細(xì)胞數(shù)量、對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生HBsAg特異性Th1類細(xì)胞因子（IFN-γ及IL-2）及對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響。顯示乙肝疫苗聯(lián)合 B7-H1蛋白免疫各組與相同劑量 HBsAg蛋白單獨(dú)免疫組相比，分泌IFN-γ的HBsAg特異性T細(xì)胞數(shù)量下降，IL-2均明顯減低（P＜0.05

7、），但 IFN-γ無(wú)明顯差異，脾淋巴細(xì)胞分泌 IFN-γ的水平各組間無(wú)明顯差異；MTT法測(cè)定的淋巴細(xì)胞增殖能力各組間也無(wú)明顯變化。
　　上述研究結(jié)果表明，B7-H1蛋白疫苗雖然可以誘導(dǎo)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生明顯的抗B7-H1抗體應(yīng)答，但不能增強(qiáng)抗HBsAg的免疫應(yīng)答。較小劑量的HBsAg即可引起HBV轉(zhuǎn)基因小鼠TH1類細(xì)胞因子（IFN-γ及IL-2）的分泌以及淋巴細(xì)胞增殖。
　　本研究結(jié)果也提示，單純通過(guò) B7-H1蛋白疫苗免