重組乙型肝炎疫苗

1、重組乙型肝炎疫苗,——動物細(xì)胞工程制藥 制作者：黃玉玲,背景,乙型肝炎是由病毒引起的，約占所有病毒性肝炎的40﹪，它可以急性發(fā)病，也可以形成慢性肝炎，并進(jìn)而引發(fā)肝硬化，肝癌，而其中很大一部分人可以是健康的病毒攜帶者，不出現(xiàn)癥狀，但表面抗原（HbsAg）陽性，或者同e抗原（HbeAg）陽性，常常是重要的傳染源。在我國，人口眾多，而這樣的慢性病毒攜帶者約有一億人，是

2、對公共衛(wèi)生的一個重要威脅。,乙肝病毒屬DNA病毒科，有三種外殼的基因編碼。乙肝病毒具有五種抗原抗體系統(tǒng)：即表面抗原抗體(HBsAg與抗-HBs)、e抗原抗體(HBeAg與抗-HBe)、核心抗原抗體(HBcAg與抗-HBc)、x抗原抗體(HBxAg與抗-HBx)和HBv-DNA。有臨床意義的主要有HBsAg與抗-HBs、HBeAg與抗-HBe和抗-HBc，簡稱“兩對半”。 　　臨床主要表現(xiàn)為食欲減退、惡心、厭油、乏力、鞏膜黃染、黃色尿、

3、肝臟腫大、肝區(qū)痛等。,簡介,重組乙型肝炎疫苗是由重組酵母或重組CHO工程細(xì)胞表達(dá)的乙型肝炎表面抗原，經(jīng)純化、滅活及加入佐劑吸附制成。前者為重組酵母乙型肝炎疫苗，后者為重組CHO乙型肝炎疫苗。其性狀為白色混懸液，靜置形成可搖散的沉淀。,疫苗用法,(2)注射部位為上臂三角肌肌內(nèi)。 (1)本疫苗注射時要充分搖勻。 (3)新生兒第1針在出生后24小時內(nèi)注射，1個月及6個月后注射第2、3針;其他人群免疫程序為第0、1、6個月，劑量均為5ug/

4、支。,疫苗制備,取國家批準(zhǔn)的重組酵母乙型肝炎疫苗的原始菌種，經(jīng)一代擴(kuò)增，制成生產(chǎn)菌種，逐級擴(kuò)增后接種于發(fā)酵罐，在適宜溫度和時間內(nèi)進(jìn)行三級發(fā)酵，收集細(xì)胞，經(jīng)破碎，吸附粗提，疏水色譜法精提乙型肝炎表面抗原，再經(jīng)硫氰酸鹽處理，除菌濾過，甲醛滅活，氫氧化鋁吸附等，加入硫柳汞作為防腐劑。 取國家批準(zhǔn)的重組CHO乙型肝炎疫苗的細(xì)胞株，用靜置培養(yǎng)或旋轉(zhuǎn)法培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)乙型肝炎表面抗原的分泌量達(dá)到每1.0mg/L時，收獲培養(yǎng)液，經(jīng)硫酸銨鹽析，2～3次密

5、度梯度離心和色譜法純化后，再經(jīng)濃縮，除菌濾過，甲醛滅活，氫氧化鋁吸附等，加硫柳汞作為防腐劑，分裝制成。,鑒別與檢查,【鑒別 】 取本品，照《中國生物制品規(guī)程》酶聯(lián)免疫吸附法，與已知乙型肝炎表面抗體確證其為乙型肝炎表面抗原。 【檢查】照《中國生物制品規(guī)程》規(guī)定的方法檢查如下項目。 　　純度 不得低于98%。 　　氫氧化鋁 每1ml不得過1mg。 　　硫柳汞 不得過0.01%。 　　甲醛 不得過0.01%。 　　異常毒性 取

6、本品，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 　　熱原 取本品，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。 　　無菌 取本品，用直接接種法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。,【效價測定】取本品，照《中國生物制品規(guī)程》測定，應(yīng)符合規(guī)定。 　　酵母乙型肝炎疫苗的ED50不得過1.5μg。體外相對效力試驗抗原含量與參比苗的抗原比值不低于0.5。 　　CHO乙型肝炎疫苗的ED50與參比苗的ED50比值不低于1.0。 　　【類別】亞單位疫苗。 　　【規(guī)格】酵母乙型肝炎疫苗 0.5ml:

7、5μg 　　CHO乙型肝炎疫苗 1ml:10μg 　　【貯藏與效期】在2～8℃的暗處保存。有效期2年。,重組乙型肝炎疫苗的種類及生產(chǎn)現(xiàn)狀,血源乙肝疫苗經(jīng)過十年上億人份人群接種，證明具有良好的安全性的免疫原性，但存在對生產(chǎn)者和獻(xiàn)血者健康有潛在危險性，生產(chǎn)成本高等缺陷，我國已經(jīng)完成同重組乙肝疫苗對血源疫苗的替代工作。 　　目前重組乙肝疫苗主要分為酵母，（釀酒酵母和甲基營養(yǎng)型酵母）以及中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster O

8、vary cell,CHO）表達(dá)疫苗。,（一）釀酒酵母,1982年Valenzuela首先在釀酒酵母中成功表達(dá)乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），1986年9月美國默克公司的重級酵母乙肝疫苗首次取得專利并得到美國FDA的批準(zhǔn)。1989年7月比利時史克比成公司的另一重組酵母乙肝炎疫苗也取得專利。目前重組酵母乙肝疫苗的生產(chǎn)廠家除默克公司，史克公司外，我國北京天壇生物，深圳康泰公司也大量生產(chǎn)該種疫苗。其優(yōu)點(diǎn)為：酵母為低等真核微生物，易于在營養(yǎng)

9、成份簡單的培養(yǎng)基中高密中發(fā)酵培養(yǎng)，利用工業(yè)化生產(chǎn)，表達(dá)量高，目前世界上大規(guī)模生產(chǎn)和上市的疫苗大多數(shù)由該表達(dá)系統(tǒng)制備而成。,（二） 甲基營養(yǎng)型酵母,共有4種表達(dá)系統(tǒng)。甲基營養(yǎng)型酵母生產(chǎn)HbsAg具有培養(yǎng)基廉價，目的基因與酵母染色整合的優(yōu)點(diǎn)， 不僅可克服質(zhì)粒丟失，還可提高表達(dá)量。漢遜酵母（Hansenula Polymorpha，H.P.）和畢赤酵母（Pichia Pastoris，P.P.）系統(tǒng)已應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。已上市的釀酒酵母和甲基營

10、養(yǎng)型酵母表達(dá)乙肝疫苗為含HbsAg成份的疫苗。,（三） CHO疫苗,本疫苗系用基因工程技術(shù)將乙型肝炎表面抗原基因片段重組到中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)內(nèi)，通過對細(xì)胞培養(yǎng)增殖，增殖分泌乙肝表面抗原(HBsAg)于培養(yǎng)液中，經(jīng)純化加佐劑氫氧化鋁后制成。疫苗外觀有輕微乳白色沉淀。,國產(chǎn)酵母乙肝疫苗的效果,研究證明：國產(chǎn)血源乙肝疫苗的保護(hù)效果至少維持9-10年，國產(chǎn)重組乙肝疫苗（主要為酵母疫苗）的免疫效果和免疫持久性如何，是人們關(guān)心的重點(diǎn)。因為乙

11、肝病毒缺乏易感動物模型，乙肝疫苗的免疫效果考核只能應(yīng)用人體考核來評價，既往研究證明應(yīng)用乙肝苗阻斷HbsAg、HbeAg雙陽性母親的新一兒傳播HBV是評價乙肝疫苗的效力的最直接指標(biāo)，且1-10歲兒童對乙肝疫苗反應(yīng)較好。我們選擇新生兒和兒童作為疫苗考核對象，進(jìn)行國產(chǎn)酵母乙肝疫苗的免疫效果和持久性研究。階段結(jié)果報告如下：,免疫效果,新生兒（1） 母嬰傳播阻斷保護(hù)率：應(yīng)用6批國產(chǎn)量5 μg酵母疫苗對163例HbsAg，HbeAg雙陽性母親的新

12、生兒進(jìn)行母嬰傳播阻礙斷效果考核，結(jié)果保護(hù)率在81.48-92.07%之間，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報道的10 μg（59.2%）和20 μg（74.3%）血源乙肝疫苗,與30 μg血源乙肝疫苗的保護(hù)率(85.1%)相當(dāng),而進(jìn)口5 μg M苗(46例,)10 μgA苗(58例)和10 μg S酵母疫苗(30例)的保護(hù)率分別為90.33%、86.59%和92.58%。表明國產(chǎn)酵母疫苗免疫效果達(dá)到國外同類產(chǎn)品和30 μg國產(chǎn)血源乙肝疫苗的保護(hù)水平。 2）

13、 抗體GMT：未發(fā)現(xiàn)第一針免后3、9、12月時，HbsAg、HbeAg雙陽性孕婦所生新生兒的抗體GMT與HbsAg單陽性及健康孕婦所生新生兒抗體GMT有顯著差異。,小學(xué)生： 　?。?） 抗體陽性率：第一針免后1年時，進(jìn)口酶母疫苗，國產(chǎn)酵母疫苗和國產(chǎn)CHO疫苗抗體陽性率在第一針免疫后3、9、12月均無顯著差異。 　?。?） 抗體CMT比較：第一針免后一年時，進(jìn)口酶母疫苗（10 μg）和國產(chǎn)CHO疫苗（10 μg）抗體GMT峰值較高，國

14、產(chǎn)酵母疫苗（5 μg）較低。,免疫持久性,對應(yīng)用0、1、6月程序免疫的小學(xué)生進(jìn)行了隨訪觀察。隨訪年及3年時，2批國產(chǎn)酵母疫苗具有保護(hù)性抗體（10mIU/ml）的陽轉(zhuǎn)率分別為81.48%；68.66%和92.11%；74.14%，而進(jìn)口A和M疫苗分別為90.38%；69.56%和93.10%；78.05%。2批國產(chǎn)酵母疫苗抗體GMT分別為123.99；146.10和92.11；83.52，A和M疫苗分別為120.56；67.07和145.

15、75；74.62。,對應(yīng)用0、1、2月程序免疫的400名小學(xué)生進(jìn)行了免后4年的隨訪觀察，結(jié)果3批國產(chǎn)酵產(chǎn)疫苗陽性率分別為87.50%；77.33%；79.49%，而對照M（5 μg）疫苗為91.89,抗體GMT分別為：65.57；71.40；59.20和74.84。由抗體峰值6月至4年時，3批國產(chǎn)疫苗抗體陰轉(zhuǎn)率分別為7.2；5.26和13.79%，對照M苗為5.17%。無論抗體陽性一率，抗體GMT以及4年抗體陰轉(zhuǎn)率，3批國產(chǎn)疫苗和M苗間

16、增無顯著差異。,我們最近隨該結(jié)果表明，2批國產(chǎn)酵母乙肝疫苗免后5年時抗體陽性率已降至70%以下，而同期血源乙肝抗體陽性率在81-69%之間。 　　結(jié)果表明：國產(chǎn)酵母重組乙肝疫苗的近期免疫效果達(dá)到了進(jìn)口酵疫苗的免疫水平，但抗體陽性率和抗體GMT下降較快，考慮當(dāng)前乙肝疫苗供應(yīng)充足，酵母疫苗的加強(qiáng)接種應(yīng)提到議事日程。,乙肝疫苗的發(fā)展,（一）聯(lián)合疫苗： 　　聯(lián)合疫苗具有減少注射針次、接種副反應(yīng)及提高接種覆蓋率的優(yōu)點(diǎn)。已上市的聯(lián)合疫苗如SB公

17、司的百白破-乙肝四聯(lián)疫苗、甲-乙肝聯(lián)合疫苗，MSD公司的流感嗜血桿菌乙型肝炎偶聯(lián)疫苗等。我國全細(xì)胞百白破-乙肝四聯(lián)疫苗和無細(xì)胞百白破-乙肝四聯(lián)疫苗已完成臨床前研究，甲-乙肝聯(lián)合疫苗的開發(fā)研究制也在進(jìn)行。,（二）治療性疫苗 　　1） 現(xiàn)有疫苗增加前S基因或替換現(xiàn)有鋁佐劑 　　研究開發(fā)植物來源、細(xì)胞因子、人工合成和可生物降解的高分子聚合物等佐劑，目的在于提高細(xì)胞免疫效果，國外已有制品進(jìn)行臨床研究。 　　2） DNA疫苗：可以肌肉細(xì)胞內(nèi)

18、表達(dá)乙肝表面抗菌原，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時具有長期表達(dá)抗原，可減少加強(qiáng)免疫及成本低，儲存方便的特點(diǎn)。 3） 增大劑量酵母疫苗（10 μg/支）的生產(chǎn)： 　　我國現(xiàn)階段生產(chǎn)和使用的酵母乙肝疫苗均為5 μg/支，由于以下原因：①、實際應(yīng)用反映5 μg酵母疫苗的抗體陽性率和滴度較低。②、我們對接種5 μg疫苗的120例成人進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)免后抗體陽性率和滴度較低，第二針免后1個月時抗體陽性率為70.00%，抗體GMT為9.83；完成全程免疫

19、后1個月時抗體陽性率為80.77%，抗體GMT為151.46。③、MSD疫苗成人劑量為10 μg/支。目前國內(nèi)正進(jìn)行10 μg疫苗的臨床考核。此外還應(yīng)結(jié)合臨床（血透析，腎臟移植等）和實際需要，生產(chǎn)不同劑量的乙肝疫苗。,（三）對現(xiàn)有疫苗生產(chǎn)線的生產(chǎn)能力進(jìn)一步開發(fā)，以及研制高表達(dá)量的新一代重組乙肝疫苗，以降低成本，提高疫苗的覆蓋率。 　　（四）加強(qiáng)疫苗保護(hù)機(jī)制和免疫持久性的研究。,后記,重組乙型肝炎疫苗的制造，顯然給眾多患者帶來了很大的福