乙型肝炎病毒基因變異對T細胞免疫學(xué)應(yīng)答影響的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景: 乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染可引起包括無癥狀攜帶、慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)、肝硬化和肝癌的一系列肝臟疾病譜。全世界大約有3億人已經(jīng)成為HBV慢性攜帶者,我國的HBV感染者約為1.1億,約有3000萬的乙型肝炎患者,全國每年死于與HBV感染相關(guān)肝病約30萬人。目前尚無徹底清除HBV的理想藥物,因此HBV感染已經(jīng)成為嚴重影響我國人民健康的公共衛(wèi)生問題。

2、HBV是非常容易發(fā)生變異的DNA病毒,而基因型和亞型變異是最常見的HBV基因變異形式,可以影響HBV基因型間差異超過全長8%序列,而且基因型的分布存在明顯的地理分布特點和人種差異;還有YMDD變異、前C區(qū)變異、BCP變異等點突變可以影響HBV的生物學(xué)功能。因為特異性淋巴細胞表位(epitope)是特異性細胞免疫應(yīng)答得以激發(fā)的主要原動力,處于免疫識別和免疫激活的核心位置[1]。當變異位點涉及HBV表位序列時,可能會影響宿主針對HBV的免疫

3、應(yīng)答能力。因為目前HBV表位主要由歐美國家學(xué)者鑒定,這些國家的HBV基因型主要以A、D為主。以HLA-A*0201限制性HBcAg18-27特異性CTL表位FLPSDFFPSV(C18-27V)為例,它被認為是表位研究中的經(jīng)典序列,是從歐、美地區(qū)的主要流行病毒株基因型A、D中鑒定出來的;而在我國HBV基因型背景下,C18-27的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化。鑒于HBV基因型和基因亞型之間的較大序列差異,鑒定適合我國病毒學(xué)背景研究的新表位,用合適的

4、HBV表位序列探究我國HBV基因(型)變異與細胞免疫應(yīng)答規(guī)律將有重要的研究意義。 目的: 調(diào)查在我國HBV優(yōu)勢基因型中,C18-27V/I變異體的分子流行病學(xué)特點和在細胞免疫學(xué)研究中的差異;通過B、C基因型特異性多肽池(pool)調(diào)查研究我國HBV感染者T淋巴細胞免疫特點,并篩選適合HBV特異性T細胞表位鑒定的調(diào)查人群;比較HBV基因型間、熱點變異組間T淋巴細胞免疫功能差異。 方法: 1.通過GenBan

5、k中上傳的30條HBV基因序列分析和本室測序的20條序列以DNASIS軟件對比分析,研究C18-27V/I的分布特點;應(yīng)用生物學(xué)軟件分析基因B、C型的C基因序列,并構(gòu)建C18-27V/I變異體的PCR-RFLP檢測方法;應(yīng)用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測并比較C18-27V/I與HLA分子的結(jié)合力預(yù)測分值變化; 2.從我室保存的全國HBV基因型調(diào)查血清庫中,選擇160份血清,通過自行構(gòu)建的PCR-RFLP法檢測,并調(diào)查C18-27V/I變異

6、體的流行病學(xué)特點; 3.在我國流行分布的C18-271優(yōu)勢背景下,選取南方醫(yī)院住院的57例慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細胞,應(yīng)用四聚體染色技術(shù)、體外增殖培養(yǎng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點試驗,比較外周血中C18-27I特異性淋巴細胞的頻數(shù)與C18-27V特異性淋巴細胞頻數(shù)的差別,以及分析兩者間T淋巴細胞功能上的差異; 4.檢測57例慢性乙型肝炎患者臨床常規(guī)指標(ALT、TBil、HBVDNA)以及HBV基因型,比較分析C18-27V/

7、I特異性淋巴細胞頻數(shù)與這些臨床指標的相關(guān)關(guān)系; 5.依據(jù)我國HBV基因型B、C中的特點,參考20條GenBank序列,設(shè)計針對我國HBV基因型B、C重疊多肽;并且設(shè)計混合多肽pool,以便在我國HBV基因背景下檢測淋巴細胞的特異性應(yīng)答反應(yīng); 6.選取南方醫(yī)院感染內(nèi)科住院的38例HBV感染者的外周血淋巴細胞,以及10例健康對照者的外周血淋巴細胞,依據(jù)HBV感染的臨床特點將患者分成HBeAg陰性慢性乙型肝炎組、HBeAg陽性

8、慢性乙型肝炎組、HBV感染肝衰竭組、肝硬化組等,通過多肽誘導(dǎo)IFN-γ分泌,酶聯(lián)免疫斑點實驗進行檢測,比較不同臨床組間特異性T淋巴細胞分泌功能的差異; 7.分析38例樣本的酶聯(lián)免疫斑點實驗的結(jié)果,比較本研究設(shè)計的不同基因型多肽pool間在誘導(dǎo)HBV特異性淋巴細胞分泌的差異; 8.檢測38例HBV感染者HBV基因型,分析B、C基因型患者間特異性T淋巴細胞應(yīng)答反應(yīng)差異; 9.檢測38例HBV感染者前C區(qū)變異、BCP變

9、異,分析變異陽性與陰性組間特異性T淋巴細胞應(yīng)答反應(yīng)差異; 10.收集38例HBV感染者臨床資料,分析臨床常規(guī)指標(ALT、TBil、HBVDNA)與HBV特異性淋巴細胞功能的關(guān)系; 結(jié)果: 1.通過比對GenBank序列發(fā)現(xiàn)C18-27I在各國基因B、C型的流行株中有廣泛的分布,而C18-27V則在其它基因型流行株廣泛分布; 2.我們成功構(gòu)建了一種PCR.RFLP的方法,可以在基因B、C流行區(qū)簡便快捷的篩

10、選C18-27V/I變異體; 3.通過來自全國8省市的160份血清調(diào)查,發(fā)現(xiàn)在我國主要流行的B、C基因型中,C18-271毒株成為主要病毒學(xué)背景,陽性率98.12%(157/160); 4.C18-27V/I四聚體染色慢性乙型肝炎外周血淋巴細胞結(jié)果提示:在C18-271病毒學(xué)背景下HLA-A2患者外周血C18-27I特異性淋巴細胞較C18-27V特異性淋巴細胞頻數(shù)高(0.335±0.479%vs0.221±0.392%)

11、,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012); 5.經(jīng)過C18-27V/I肽誘導(dǎo)后C18-27V/I四聚體及CD8雙陽性細胞比誘導(dǎo)前明顯增殖(2-10倍),其中C18-27I誘導(dǎo)淋巴細胞增殖能力高于C18-27V肽,并發(fā)現(xiàn)兩肽之間在誘導(dǎo)增殖方面存在明顯的交叉反應(yīng); 6.C18-27V/I肽分別誘導(dǎo)12例HLA-A2陽性慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細胞并直接酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測IFN-γ分泌,兩肽均未誘導(dǎo)出陽性斑點; 7.通

12、過序列比對,我們設(shè)計了HBV基因B、C型覆蓋HBV全長的282條重疊多肽,每肽18個氨基酸,相鄰多肽重疊10個氨基酸;并設(shè)計了10個多肽pool,每pool包含22-34條肽,分別區(qū)分兩種HBVB/C基因型,區(qū)分HBVX、C、S和P基因區(qū); 8.將38例HBV感染者和10例健康獻血員分成HBeAg陰性慢性乙型肝炎組(G1=12)、HBeAg陽性慢性乙型肝炎組(G2=11)、急性肝衰竭組(G3=5)、肝硬化(G4=8)、急性HBV

13、感染組(G5=2)、特殊HBV標志物組(G6=4)和健康對照組(G7=6);G7組的斑點均數(shù)為(2.208±3.924SFC),確定陽性pool的Cutoff=10SFC; 9.酶聯(lián)免疫斑點試驗比較各組間(G1-G7)斑點分布結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(X2=15.277,P=0.018);在慢性HBV感染組(G1-G4)中進行比較,組間各樣本總斑點數(shù)之間差異不顯著(X2=6.5,P=0.088),但陽性pool的數(shù)量差異顯著,有統(tǒng)計

14、學(xué)意義(X2=9.2,P=0.027);進一步比較G1、G2組間樣本的陽性pool數(shù),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(z=-2.345,P=0.019),陽性pool病例數(shù)之間的差異也有統(tǒng)計學(xué)的意義(X2=5.856,P=0.016); 10.HBV感染各組(G1-G5)中,有HBVDNA檢測結(jié)果的36例資料,分析ALT水平與淋巴細胞分泌IFN-γ總斑點均數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系,經(jīng)非參數(shù)相關(guān)檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義(CC=0.352,P=0.030);log

15、DNA與淋巴細胞分泌IFN-γ總斑點數(shù)有負相關(guān)趨勢,但經(jīng)非參數(shù)相關(guān)分析無統(tǒng)計學(xué)意義(CC=-0.114,P=0.495); 11.檢測發(fā)現(xiàn)HBV基因B型(23例)比基因C型(9例)患者有較高的特異性淋巴細胞總斑點數(shù),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(z=-2.517,P=0.012);分別比較兩型問代表S基因區(qū)pool總斑點數(shù)的(Sgene)和代表P基因區(qū)pool總斑點數(shù)的(Pgene)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(z=-2.194,P=0.028;z=-

16、2.479,P=0.013);而兩型間代表X基因區(qū)和C基因區(qū)的斑點數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(z=-1.635,P=0.102;z=-0.728,P=0.467); 12.發(fā)現(xiàn)前C變異和BCP變異陽性組在樣本總斑點數(shù)和代表C基因區(qū)的斑點數(shù)較對應(yīng)的陰性組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,C基因區(qū)的斑點數(shù)在變異組中有升高趨勢; 結(jié)論: 1.C18-27I毒株是我國HBV感染者的主要病毒學(xué)背景;在此背景下,外周血C18-27I的特異性淋巴細胞

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