增強戊型肝炎病毒基因免疫體液免疫應(yīng)答的策略.pdf

1、戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是無包膜的單股正鏈RNA病毒，主要通過胃腸道傳播，是引起急性戊型肝炎(Hepatitis E，HE)的病原體。目前HE尚無特異有效的抗病毒治療藥物，因此，HEV疫苗在有效控制HE中的作用受到人們的重視，被WHO列為21世紀優(yōu)先發(fā)展的疫苗之一。 要成功研制預(yù)防用 HEV疫苗，關(guān)鍵在于該疫苗能否誘導出具有保護作用的中和抗體，因為靈長類動物實驗已多次證實體液免疫應(yīng)答在阻斷 HE

2、V的感染中發(fā)揮了重要的作用。而中和抗體的產(chǎn)生必須基于HEV中和抗原表位對機體免疫系統(tǒng)的刺激。我們在先前的研究中，利用抗原mapping技術(shù)和基于PCR的體外中和試驗在國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)HEV中和抗原表位是一種構(gòu)型依賴性表位，位于HEV ORF2編碼蛋白的第452至617位氨基酸之間。研究結(jié)果為研制基于中和表位的HEV疫苗奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。但是，由于 HEV細胞培養(yǎng)十分困難，難以研制傳統(tǒng)的滅活疫苗和減毒活疫苗，目前的HEV候選疫苗主要是通過基因

3、工程技術(shù)制備的重組蛋白。而基因疫苗因其具有制備簡單、性質(zhì)穩(wěn)定、可天然地表達抗原蛋白、同時誘導特異性體液和細胞免疫應(yīng)答等優(yōu)點也倍受人們關(guān)注，并已開始用于HEV疫苗的研究。 在本研究中，我們以美國FDA首次批準能用于人體試驗的真核表達載體pWAX1構(gòu)建含HEV中和抗原表位的HEV-ORF2<'439～617>(p179)為靶基因的重組質(zhì)粒，以肌肉注射法進行基因免疫，觀察該基因疫苗在小鼠體內(nèi)誘導HEV特異性體液免疫應(yīng)答的效果；在此基礎(chǔ)

4、上，在p179編碼基因的5'端插入通用信號肽(tPA)編碼序列，探討真核表達載體產(chǎn)生的分泌性靶抗原能否增強基因免疫誘導的特異性抗體水平。同時，引入分子佐劑C3d，探討C3d對基于HEV中和表位-p179基因疫苗誘導的免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。 方法： 將HEV-p179、HEV-tPA-p179和3拷貝的C3d編碼基因分別插入真核表達載體pVAX1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVAX-179、pVAX-tPA-179、pVAX-179-C3

5、d3和pVAX-tPA-179-C3d3。米用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將上述四種重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞和7721人肝癌細胞，并以 Western blot法和間接免疫熒光法檢測靶抗原的表達；RT-PCR法檢測pVAX-179-C3d3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的真核細胞中p179和p179-C3d3融合蛋白在mRNA水平的表達；pVAX-179和pVAX-179-C3d3轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞后收集細胞裂解液上清、分別與CR2<'+>Raji細胞

6、孵育，通過間接免疫熒光法檢測p179-C3d3融合蛋白體外結(jié)合C3d受體(CR2)的功能；采用肌肉注射法分別于0、2、4周對BALB/c小鼠分組實施基因免疫(100μg/100μl/只小鼠，每組8只小鼠)，設(shè)pVAXl組為對照；定期采集血清標本，ELISA法檢測各組小鼠血清中抗HEV-p179 IgG及其亞類，并以硫氰酸鹽洗脫法檢測血清特異性IgG抗體的親合力；分離免疫小鼠第12周脾細胞，經(jīng)體外特異性抗原p179蛋白刺激72h后，采用E

7、LISA法檢測培養(yǎng)上清的細胞因子。 結(jié)果： 1. 酶切實驗及DNA序列分析證實：成功構(gòu)建了基于中和抗原表位-p179的真核表達質(zhì)粒： pVAX-179、pVAX- tPA-179、pVAX-179-C3d3和pVAX-tPA-179-C3d3。間接免疫熒光及Western blot檢測顯示：與空質(zhì)粒pVAX1作對比，pVAX-179、pVAX-tPA-179、 pVAX-179-C3d3均能在體外真核細胞中有效地表達目的

8、抗原-p179。RT-PCR檢測目的基因的mRNA，結(jié)果顯示在pVAX-179-C3d3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞中，不僅可以檢測到p179 mRNA、而且能檢測出p179-C3d3融合蛋白的mRNA。設(shè)計間接免疫熒光法檢測 p179-c3d3融合蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)p179-C3d3融合蛋白具有與C3d受體-CR2特異性結(jié)合的能力。這些結(jié)果提示在目的抗原基因5'端插入信號肽(tPA)編碼基因以及3 '端連接3拷貝的C3d編碼基因均不影響p179抗原的表

9、達及其抗原性；p179-C3d3融合蛋白不影響其中C3d分子與其受體CR2特異性結(jié)合的功能。 2. 檢測pVAX-179質(zhì)粒免疫小鼠后誘導的血清特異性抗HEV IgG抗體，發(fā)現(xiàn)小鼠于第4周開始產(chǎn)生抗體，第8周達到高峰，抗體的親和力略高于p179蛋白免疫(第10周的 ED<,50>2.5 vs 2.0)，IgG亞類以IgG2a為主，中和實驗的結(jié)果提示pVAX-179基因免疫誘導的抗體具有體外中和病毒的作用，中和效價為1：1。

10、 3. 比較pVAX-179和pVAX-tPA-179免疫小鼠血清的特異性IgG抗體水平，發(fā)現(xiàn) pVAX-tPA-179基因免疫組比pVAX-179基因免疫組提前1-2周產(chǎn)生特異性抗HEV抗體、而且抗體水平高于pVAX-179組；抗體亞類檢測結(jié)果顯示pVAX-tPA-179誘導的抗體亞類以IgG2a為主，但更加顯著地提高了IgGl的水平。提示引入通用信號肽而產(chǎn)生分泌性的p179增強了基因疫苗誘導的抗體水平，并促進基因疫苗向體液免疫方向

11、發(fā)展。親合力檢測的結(jié)果顯示pVAX-tPA-179免疫小鼠誘導的抗HEV抗體的親合力與 pVAX-179組小鼠的親合力相比沒有顯著差別(第8周的ED<,50>：2.5 vs 2.3)，中和實驗的結(jié)果顯示抗體的中和效價仍為1：1。 4. 分別在p179和tPA-179融合蛋白的C端引入3拷貝的C3d分子，以探討分子佐劑C3d對基于中和表位-p179的基因免疫的增強作用。檢測重組質(zhì)粒pVAX-179、pVAX-tPA-179、 pV

12、AX-179-C3d3和pVAX-tPA-179-C3d3免疫小鼠的血清特異性IgG及IgG亞類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：pVAX-179-C3d3免疫組誘導的特異性抗HEV IgG水平顯著高于pVAX-179重組質(zhì)粒免疫組(p<0.01)，pVAX-tPA-179-C3d3重組質(zhì)粒免疫組誘導的特異性抗HEV IgG水平不僅顯著高于pVAX-179重組質(zhì)粒免疫組(p<0.001)而且顯著高于pVAX-tPA-179免疫組(p<0.05)。檢測小鼠血清

13、第六周和第八周的抗體親和力發(fā)現(xiàn)pVAX-tPA-179-C3d3質(zhì)粒免疫誘導的抗體親合力水平(ED<,50>由第6周的2.3上升到了第8周的3.2)明顯高于 pVAX-179組(第8周的ED<,50>為2.3)SNpVAX-tPA-179組(第8周的ED<,50>為2.5)。中和實驗的結(jié)果顯示抗體的中和效價達到了1：16。提示分子佐劑C3d能增強HEV基因免疫的體液免疫應(yīng)答。探討C3d增強HEV體液免疫應(yīng)答的機理發(fā)現(xiàn)分別與pVAX-17

14、9和pVAX- tPA-179重組質(zhì)粒免疫組相比，pVAX-179-C3d3和pVAX-tPA-179-C3d3基因免疫雖然沒有改變特異性IgG亞類的格局一仍以IgG2a為主，但IgG1亞類抗體水平提高顯著，誘導了小鼠免疫應(yīng)答往體液免疫應(yīng)答的方向發(fā)展；ELISA法檢測免疫小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子IL-4的水平，發(fā)現(xiàn)pVAX-179-C3d3組和pVAX-tPA-179-C3d3組小鼠脾細胞在p179蛋白的剌激下，分泌的IL-4水平均

15、高于-pVAX-179組，這進一步證實了C3d具有增強小鼠體液免疫應(yīng)答的作用。 結(jié)論： 1．成功構(gòu)建了基于戊型肝炎病毒中和表位p179的真核表達載體：pVAX-179、pVAX-tPA-179、pVAX-179-C3d3和pVAX—tPA-179-C3d3； 2．基于戊型肝炎病毒中和表位p179基因疫苗在小鼠體內(nèi)成功誘導了抗HEV-IgG抗體應(yīng)答，并且抗體具有中和作用。 3．靶抗原基因N端引入通用信號肽序