基于中和表位的戊型肝炎病毒基因免疫的研究.pdf

1、戊型肝炎(hepatitisE，HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus，HEV)引起的急性病毒性肝炎，具有發(fā)病急、癥狀重、死亡率高等特點[1]。HEV有4個主要的不同基因型(Ⅰ-Ⅳ型)，流行病學(xué)資料顯示Ⅳ型HEV是引起我國散發(fā)性戊型肝炎的主要病毒株[2]。目前HE尚無有效的抗病毒治療藥物，因此HEV疫苗在HE防治中的作用受到人們的重視[3]?；蛞呙缡且环N倍受人們關(guān)注的新興疫苗，具有制備簡單、性質(zhì)穩(wěn)定，特別是具有可同時誘

2、導(dǎo)特異性體液免疫和細胞免疫等優(yōu)點，已用于HEV疫苗的研究[4]。我們在以往的研究中發(fā)現(xiàn)HEV中和抗原表位位于其基因組第二讀碼框架(openreadingframe2，ORF2)編碼蛋白的第452-617位氨基酸之間[5,6]，鑒于中和抗原表位在誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答中的重要作用，本研究在獲得了來源于一株第Ⅳ基因型的HEV毒株且含中和表位的抗原片段-p166、p179基因編碼序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了4種不同的真核重組表達質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)染真核細胞并局

3、部注射小鼠肌肉組織，檢測它們在體內(nèi)、體外的抗原表達水平并探討載體和目的基因的選擇對抗原在真核細胞內(nèi)表達的影響；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒基因免疫小鼠，觀察其免疫效果。 方法： 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR(RT-nested-PCR)法從一只感染HEV的彌猴的糞便懸液中擴增獲得HEVORF2G6461～G7035基因編碼序列，進行序列測定后與Genbank中已知的4個主要基因型的HEV代表株相應(yīng)基因序列進行序列比對，以確定該HEV毒株的基

4、因型；設(shè)計特異性引物，以O(shè)RF2G6461～G7035為模板，應(yīng)用PCR法擴增HEV-p166和p179的基因編碼序列；將此基因序列分別克隆入不同的真核表達載體pTR421和pCDNA3.1中，構(gòu)建4種不同的真核重組表達質(zhì)粒pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179，并進行雙酶切鑒定和序列測定；應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將己構(gòu)建的4種不同的真核表達質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染HepG2人肝癌細胞并局部注射小鼠肌

5、肉組織；應(yīng)用免疫熒光法和Western-blotting法檢測目的抗原在體外HepG2細胞中的表達水平；應(yīng)用免疫組化法檢測目的抗原在小鼠局部肌肉組織中的表達水平；將能夠在體內(nèi)和體外真核細胞中有效表達目的抗原的真核重組表達質(zhì)粒pTR421-179基因免疫小鼠，定期眼眶采血，分離血清，間接ELISA法檢測血清中特異性IgG抗體水平并觀察其動態(tài)變化；分離pTR421-179基因免疫后小鼠的脾細胞，MTT法檢測其在特異性抗原HEV-p179刺激

6、下的增殖水平。 結(jié)果： 經(jīng)序列測定和比對后確定該HEVORF2G6461～G7035序列來源于第Ⅳ基因型病毒株；獲得了含中和表位的HEV-p166和p179目的抗原的基因編碼序列；成功構(gòu)建了4種不同的真核重組表達質(zhì)粒pTR421-166、pTR421-179、pCDNA3.1-166和pCDNA3.1-179；免疫熒光和Western-blotting法可以檢測到pTR421-179在體外轉(zhuǎn)染的HepG2人肝癌細胞中表達

7、的目的抗原，免疫組化法可以檢測到pTR421-179在小鼠肌肉組織中表達的目的抗原；而應(yīng)用同樣的方法沒有檢測到其它3種重組質(zhì)粒在體外轉(zhuǎn)染的細胞中和體內(nèi)小鼠肌肉組織中表達的目的抗原；與pTR421質(zhì)?；蛎庖吆蟮男∈笙啾?，pTR421-179重組質(zhì)?；蛎庖咝∈蠛?，在小鼠的血清可以檢測到抗-HEV特異性IgG抗體，抗體水平呈現(xiàn)一定的動態(tài)變化；MTT法可以檢測到pTR421-179重組質(zhì)?；蛎庖吆蟮男∈蟮钠⒓毎谔禺愋钥乖碳は碌脑鲋撤磻?yīng)

8、，與pTR421質(zhì)粒免疫組有明顯的差異。 結(jié)論： 獲得了來自于一株第Ⅳ基因型HEVORF2部分cDNA序列，并在此基礎(chǔ)上獲得了含中和表位的HEV-p166和p179抗原基因編碼序列；通過檢測不同真核重組表達質(zhì)粒在真核細胞內(nèi)目的抗原的表達，發(fā)現(xiàn)抗原編碼基因和載體的選擇對抗原在真核細胞內(nèi)的表達有一定的影響，同時得到了能在真核細胞內(nèi)有效表達HEV中和表位的重組真核表達質(zhì)粒pTR421-179；pTR421-179重組真核表達質(zhì)