基于蛋白-核酸共免疫的乙型肝炎-戊型肝炎新型聯(lián)合疫苗的研究.pdf

1、自從Edward Jenner接種牛痘預(yù)防天花以來(lái),疫苗為人類的健康做出了巨大貢獻(xiàn)。一般認(rèn)為,疫苗的發(fā)展可以分為三個(gè)階段：即以減毒活疫苗和滅活疫苗為代表的第一代疫苗,以重組基因工程蛋白亞單位疫苗為代表的第二代疫苗,以核酸疫苗為代表的第三代疫苗。然而隨著醫(yī)學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)等生物醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,疫苗種類迅速增加,同時(shí)也帶來(lái)了許多新的問題,如免疫次數(shù)增多、免疫程序復(fù)雜等等。 聯(lián)合疫苗由于能夠減少免疫接種次數(shù)、簡(jiǎn)化免疫程序、提

2、高免疫覆蓋率,因此已經(jīng)成為當(dāng)今疫苗研究的熱點(diǎn)。目前上市的聯(lián)合疫苗中,主要采用減毒活疫苗/滅活疫苗(第一代疫苗)和重組亞單位疫苗(第二代疫苗)進(jìn)行聯(lián)合制備,而有關(guān)重組蛋白亞單位疫苗(第二代疫苗)和核酸疫苗(第三代疫苗)之間的聯(lián)合疫苗的研究尚未見報(bào)道。蛋白疫苗和核酸疫苗各有其特點(diǎn)：蛋白疫苗通常能夠誘導(dǎo)較高水平的抗體,適用于預(yù)防病原生物的感染,而誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力一般較弱；核酸疫苗通常能夠引起較強(qiáng)的特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答,對(duì)于難治性感染

3、性疾病具有治療性作用,但是相對(duì)蛋白疫苗而言其誘導(dǎo)的抗體水平較低。因此根據(jù)不同的需要組成聯(lián)合疫苗,賦予聯(lián)合疫苗更多特點(diǎn)就成為一個(gè)吸引人的新課題。 本研究以乙型肝炎和戊型肝炎聯(lián)合疫苗為模型,通過蛋白-核酸共免疫的方法,研究蛋白疫苗和核酸疫苗組成的聯(lián)合疫苗的免疫原性,圍繞蛋白疫苗和核酸疫苗組成聯(lián)合疫苗的可行性和作用機(jī)制作一初步探討。 本研究主要分為兩部分： 第一部分；基于重組乙肝亞單位疫苗和戊肝核酸疫苗的新型HBV-H

4、EV聯(lián)合疫苗的研究 在以往有關(guān)重組乙肝亞單位疫苗和戊肝核酸疫苗研究的基礎(chǔ)上,采用重組乙肝亞單位疫苗和戊肝核酸疫苗制備乙肝-戊肝聯(lián)合疫苗(HBV-HEV聯(lián)合疫苗),通過研究該新型聯(lián)合疫苗的免疫原性、組分間的相互作用,為研究第二代疫苗和第三代疫苗組成聯(lián)合疫苗的可行性提供依據(jù)。 主要實(shí)驗(yàn)過程：將通過抽提質(zhì)粒pVAX-179TH制備的重組戊肝核酸疫苗和長(zhǎng)春生物制品研究所贈(zèng)予的重組乙肝亞單位疫苗物理混勻,采用大腿肌肉注射的免疫方式

5、免疫小鼠。免疫程序?yàn)?、2、4周。分組和免疫劑量如下：?jiǎn)蝺r(jià)乙肝亞單位蛋白疫苗對(duì)照組為1.5μg/只；單價(jià)戊肝核酸疫苗對(duì)照組為100μg/只；低劑量聯(lián)合免疫組為每只小鼠注射由1.5μg重組乙肝亞單位疫苗與100μg戊肝核酸疫苗組成的聯(lián)合疫苗；高劑量聯(lián)合免疫組為每只小鼠注射由3μg重組乙肝亞單位疫苗與200μg戊肝核酸疫苗組成的聯(lián)合疫苗。最后,通過ELISA檢測(cè)血清IgG抗體和IgG抗體亞類,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),評(píng)價(jià)結(jié)果。 本研究發(fā)現(xiàn),由重組

6、乙肝亞單位蛋白疫苗與重組戊肝核酸疫苗組成的候選聯(lián)合疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的針對(duì)乙肝病毒和戊肝病毒的抗體應(yīng)答,并且抗體水平不低于單價(jià)對(duì)照。在第4周各組乙肝抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)到100％,在第8周各組戊肝抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)到100％,且抗體均能持續(xù)24周以上,顯示出良好的免疫原性。高劑量的聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)的戊肝抗體水平高于低劑量聯(lián)合疫苗組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？贵w親和力的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組誘導(dǎo)的乙肝和戊肝抗體親和力差異不明顯。表明不同劑量的聯(lián)合疫苗雖然沒有表現(xiàn)出抗體

7、親和力的增強(qiáng),但與單價(jià)疫苗相比,聯(lián)合疫苗的乙肝和戊肝抗體親和力也沒有表現(xiàn)出受到削弱。 抗-HBs IgG抗體亞類顯示出以IgG1為主,而抗-HEV IgG則以IgG2a為主；提示乙肝亞單位疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答方向可能以體液免疫為主,戊肝核酸疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答方向可能以細(xì)胞免疫為主。低劑量聯(lián)合疫苗組的抗-HBs IgG的亞類IgG2a/IgG1的比例高于單價(jià)乙肝亞單位蛋白疫苗組。表明聯(lián)合疫苗能夠促進(jìn)乙型肝炎病毒特異性的Th1方向的免

8、疫應(yīng)答,并且在一定的劑量范圍內(nèi),高劑量的聯(lián)合疫苗更能增強(qiáng)這種效果。 第二部分：基于乙肝核酸疫苗和重組戊肝亞單位疫苗的新型HBV-HEV聯(lián)合疫苗的研究 上述由乙肝亞單位疫苗和戊肝核酸疫苗組成的聯(lián)合疫苗有其可行性,如果反之,以乙肝核酸疫苗和戊肝蛋白疫苗組成的聯(lián)合疫苗會(huì)產(chǎn)生怎樣的結(jié)果?因此,我們進(jìn)一步開展了基于重組戊肝亞單位疫苗和乙肝核酸疫苗的新型HBV-HEV聯(lián)合疫苗的研究。 主要實(shí)驗(yàn)過程：首先將通過抽提核酸質(zhì)粒pV

9、AON-S2/S制備的重組乙肝核酸疫苗和本實(shí)驗(yàn)室所制備的重組戊肝亞單位疫苗物理混勻。然后免疫小鼠,免疫方法為小鼠大腿肌肉注射免疫。免疫程序?yàn)?、2、4周。具體分組和免疫劑量為：?jiǎn)蝺r(jià)乙肝核酸疫苗對(duì)照組為pVAON-S2/S100μg/只；單價(jià)戊肝蛋白疫苗對(duì)照組為1μg/只；低劑量聯(lián)合疫苗組為每只小鼠注射由1μg重組戊肝亞單位疫苗與100μg乙肝核酸疫苗組成的聯(lián)合疫苗；高劑量聯(lián)合免疫組為每只小鼠注射由2μg重組戊肝亞單位疫苗與200μg乙肝

10、核酸疫苗組成的聯(lián)合疫苗。最后,通過ELISA檢測(cè)血清IgG抗體和IgG抗體亞類,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),評(píng)價(jià)結(jié)果。 研究發(fā)現(xiàn),由重組乙肝核酸疫苗與重組戊肝蛋白疫苗組成的候選聯(lián)合疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的針對(duì)乙肝病毒和戊肝病毒的抗體應(yīng)答,并且抗體水平不低于單價(jià)對(duì)照；在第6周乙肝抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)到100％,在第4周戊肝抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)劍100％,且抗體均能持續(xù)20周以上,顯示山良好的免疫原性。低劑量的聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)的戊肝抗體水平高于單價(jià)戊肝蛋白疫苗組,并且差異

11、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明聯(lián)合疫苗中的乙肝核酸疫苗促進(jìn)了戊肝抗體的產(chǎn)生,乙肝核酸疫苗在聯(lián)合疫苗的免疫過程中起了佐劑的作用。但聯(lián)合疫苗的不同劑量之間乙肝和戊肝的總IgG水平差異不明顯。 抗體親和力的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各組誘導(dǎo)的乙肝和戊肝抗體親和力差異不明顯。表明不同劑量的聯(lián)合疫苗雖然沒有表現(xiàn)出增強(qiáng)的抗體親和力,但與單價(jià)疫苗相比,聯(lián)合疫苗的乙肝和戊肝抗體親和力也沒有表現(xiàn)出受到削弱。 抗-HBs IgG抗體亞類顯示出以IgG2a為主,而抗-H

12、EV IgG則以IgG1為主,提示聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)的乙型肝炎病毒的特異性免疫應(yīng)答可能以細(xì)胞免疫為主,戊型肝炎病毒特異性免疫應(yīng)答可能以體液免疫為主。高劑量聯(lián)合疫苗組的抗-HEV IgG的亞類IgG2a/IgG1的比例高于低劑量聯(lián)合疫苗組,表明在一定劑量范圍內(nèi),高劑量聯(lián)合疫苗能夠促進(jìn)誘導(dǎo)戊型肝炎病毒特異性的Th1方向免疫應(yīng)答的能力。總結(jié)兩部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,可以發(fā)現(xiàn)兩種不同組成模式的蛋白-核酸聯(lián)合疫苗免疫原性良好,聯(lián)合疫苗中兩種組分均能誘導(dǎo)出特異性抗