天然產(chǎn)物小檗胺增強(qiáng)伊馬替尼治療慢性粒細(xì)胞白血病的療效及機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]
　　慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一種發(fā)生于造血干細(xì)胞水平的血液系統(tǒng)惡性克隆增生性疾病，在我國CML占總白血病發(fā)病率的20％左右。特征性Ph染色體是CML的標(biāo)記性改變，它是由于t(9;22)(q34;q11)染色體易位形成的，從而導(dǎo)致BCR-ABL基因融合并表達(dá)210KD的BCR-ABL融合蛋白。第一代以BCR-ABL蛋白為靶標(biāo)的分子靶向藥物—伊馬替尼(Imatinib

2、，IM)已成為治療CML的一線藥物，但其仍存在耐藥、停藥后易復(fù)發(fā)以及對(duì)CML急變療效差等諸多問題。并且，越來越多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究資料顯示，單用分子靶向藥物只能控制慢性期CML，而對(duì)加速期和急變期CML基本無效，更不能治愈CML。隨著近年來不斷深入的研究，揭示白血病干細(xì)胞(leukemia stem cell，LSC)是白血病復(fù)發(fā)和耐藥的主要根源，CML患者要獲得長期緩解和治愈，不僅需要?dú)⑺揽焖僭鲋车陌籽〖?xì)胞，而且還要清除處在休眠期的白

3、血病干細(xì)胞。令人遺憾的是，伊馬替尼類分子靶向藥物對(duì)白血病干細(xì)胞無效。
　　現(xiàn)代腫瘤的治療已從最初的單一用藥向聯(lián)合用藥方向轉(zhuǎn)變，從機(jī)制的互補(bǔ)、作用的協(xié)同、不良反應(yīng)的減輕等方面發(fā)揮作用，其中關(guān)鍵之一是聯(lián)合化療藥物的選擇。越來越多的研究證據(jù)表明傳統(tǒng)中藥(traditional Chinese medicine，TCM)是白血病治療突破新的希望之一。小檗胺（Berbamine，BBM）是從我國中草藥小檗屬植物中提取的一種雙芐基異喹啉類生物

4、堿藥物。我們前期研究結(jié)果顯示，在體外小檗胺可以有效抑制對(duì)伊馬替尼耐藥的CML細(xì)胞的增殖，并且對(duì)正常造血細(xì)胞增殖沒有明顯抑制作用。CaMKIIγ激酶是小檗胺抗慢性粒細(xì)胞白血病作用的關(guān)鍵靶分子，是白血病干細(xì)胞治療性藥物靶標(biāo)。這些證據(jù)提示著我們可以將小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合起來，從而達(dá)到對(duì)白血病更好的治療效果。因此本研究將對(duì)進(jìn)該聯(lián)合用藥的可行性及優(yōu)勢(shì)進(jìn)行分析，并對(duì)機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　[研究目的]
　　1、比較天然小分子化合物小檗胺

5、、伊馬替尼和小檗胺聯(lián)合伊馬替尼對(duì)CML細(xì)胞的清除作用;
　　2、應(yīng)用小鼠模型比較小檗胺、伊馬替尼和小檗胺聯(lián)合伊馬替尼對(duì)體內(nèi)CML藥效;
　　3、初步探討小檗胺、伊馬替尼和小檗胺聯(lián)合伊馬替尼抗白血病作用機(jī)制。
　　[研究方法]
　　1、MTT法檢測(cè)不同濃度單藥小檗胺、單藥伊馬替尼及小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合給藥方案對(duì)伊馬替尼耐藥的K562細(xì)胞或BCR-ABL T315I耐藥突變的KCL-22M的清除作用，計(jì)算聯(lián)合指數(shù)(c

6、ombination index，CI);
　　2、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度單藥小檗胺、單藥伊馬替尼及小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合給藥方案對(duì)白血病細(xì)胞系的克隆形成能力的影響;
　　3、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)Annexin-Ⅴ/PI雙標(biāo)法觀察不同濃度單藥小檗胺、單藥伊馬替尼及小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合給藥方案對(duì)白血病細(xì)胞的凋亡影響;
　　4、應(yīng)用Western blotting檢測(cè)相關(guān)信號(hào)分子，研究小檗胺聯(lián)合伊馬替尼誘導(dǎo)CML細(xì)胞死亡的

7、機(jī)制;
　　5、應(yīng)用裸鼠體內(nèi)人異種移植瘤模型評(píng)價(jià)單藥小檗胺、單藥伊馬替尼及小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合給藥方案對(duì)伊馬替尼耐藥的K562/ADR細(xì)胞生長影響。
　　[研究結(jié)果]
　　1.體外MTT證實(shí)小檗胺和伊馬替尼對(duì)K562、K562/ADR、KCL-22M、CML-BC四種細(xì)胞均有殺傷作用。72h IC50分別為:10.02±0.064μM、12.538±0.073μM、14.759±0.08μM、14.194±0.032μ

8、M和0.065±0.011μM、2.665±0.031μM、14.678±0.077μM、0.065±0.012μM;
　　2.小檗胺和伊馬替尼在CML細(xì)胞系中聯(lián)合使用CI＜1，具有協(xié)同作用，不僅可減少伊馬替尼劑量使用，并且可清除對(duì)伊馬替尼耐藥的K562細(xì)胞和BCR-ABLT315I耐藥突變的CML細(xì)胞;
　　3.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合使用可以協(xié)同抑制CML細(xì)胞克隆形成，72h MTT IC50藥物劑量聯(lián)

9、合使用后基本無克隆生長;
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合使用可協(xié)同促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡和壞死，72h MTT IC50藥物劑量聯(lián)合使用后，對(duì)K562和K562/ADR凋亡和壞死率分別達(dá)到69.1％和97.1％;
　　5.小檗胺下調(diào)伊馬替尼耐藥的K562細(xì)胞和BCR-ABL T315I耐藥突變的CML細(xì)胞融合蛋白p210 BCR-ABL水平，同時(shí)抑制CML干細(xì)胞存活必需的CaMKIIγ激酶活性。小檗胺和伊馬替尼聯(lián)

10、合后能使p210BCR-ABL蛋白水平下降更明顯;
　　6.體內(nèi)異種移植瘤證實(shí)小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合可明顯協(xié)同抑制K562/ADR細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長;裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)35天結(jié)束后發(fā)現(xiàn)在裸鼠移植瘤瘤重，瘤消退率等指標(biāo)上聯(lián)合用藥均優(yōu)于單藥，數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，且裸鼠肝、腎等重要臟器未見肉眼損害。
　　[研究結(jié)論]
　　1、小檗胺可有效清除LSCs和BCR-ABL的T315I突變細(xì)胞，小檗胺能抑制CML細(xì)胞中C

11、aMKIIγ激酶活性，殺傷CML細(xì)胞。
　　2、小檗胺和伊馬替尼聯(lián)合用藥具有協(xié)同效應(yīng)。小檗胺能顯著協(xié)同伊馬替尼殺傷CML細(xì)胞，使細(xì)胞凋亡增加;聯(lián)合用藥能協(xié)同抑制BCR-ABL及其磷酸化蛋白的表達(dá)，提示小檗胺聯(lián)合伊馬替尼可能是逆轉(zhuǎn)耐藥。
　　3、治療劑量下小檗胺對(duì)裸鼠沒有明顯的毒副作用，小檗胺聯(lián)合伊馬替尼后能有效殺滅裸鼠體內(nèi)增殖活躍的人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞
　　4、小檗胺能加強(qiáng)伊馬替尼的抗腫瘤療效，由于小檗胺的價(jià)格低廉，