EphB4受體分子致慢性髓系白血病伊馬替尼耐藥機制研究.pdf

1、研究背景:慢性髓系細(xì)胞白血病(Chronicmyeloidleukemia，CML)是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其自然病程分為慢性期(chronicphase，CP)、加速期(acceleratephase，AP)和急變期(Blastcrisis，BC)，其特點是具有克隆性的Ph染色體陽性細(xì)胞，并表達(dá)BCR-ABL融合蛋白P210，該蛋白可以產(chǎn)生持續(xù)性的酪氨酸激酶活性并最終造成腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖。甲磺酸伊馬替尼(imatinib，IM，S

2、TI571，格列衛(wèi)，諾華制藥，瑞士)就是可以抑制BCR-ABL融合蛋白激酶活性的靶向藥物，它的出現(xiàn)使得CML的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)緩解率及長期生存有了顯著的改善。隨著IM的大量應(yīng)用，我們逐漸認(rèn)識到，有相當(dāng)數(shù)量的患者會出現(xiàn)IM耐藥，包括原發(fā)耐藥與繼發(fā)耐藥。一旦患者發(fā)生耐藥性，往往是二代、甚至三代酪氨酸激酶抑制劑也不能控制病情，或者僅僅可以短期維持，繼而病情進(jìn)展直至死亡。目前，關(guān)于IM耐藥機制，最為成熟的研究為BCR-ABL激酶區(qū)域的點突

3、變，如T315I突變、P-loop突變等。然而，激酶區(qū)域點突變并不能完全解釋耐藥機制，有相當(dāng)比例的患者并不存在激酶區(qū)域的突變，研究發(fā)現(xiàn)，BCR-ABL蛋白非激酶區(qū)域的功能區(qū)異常是導(dǎo)致IM耐受的重要機制之一，越來越多的信號分子被認(rèn)為與非激酶區(qū)異常導(dǎo)致的耐藥相關(guān)，如小G蛋白Rho信號通路、Src信號通路等。因此，深入研究BCR-ABL非依賴性耐藥對于開發(fā)多靶點藥物和最終治愈CML具有重要意義。
　　 EphB4是受體酪氨酸激酶家族成

4、員之一，既往研究提示:EphB4參與的細(xì)胞生物學(xué)過程主要有細(xì)胞遷移及細(xì)胞粘附，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及血管生成密切相關(guān)。最新研究發(fā)現(xiàn)，EphB4作為骨髓微環(huán)境中的crosstalk分子，可以調(diào)節(jié)骨髓造血干細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞的相互作用，在細(xì)胞粘附介導(dǎo)的耐藥(CAM-DR)過程中發(fā)揮了樞紐作用。那么，EphB4是否與CML伊馬替尼耐藥相關(guān)呢？其作用機制如何呢？這正是本課題研究目的所在。
　　 目的:探討EphB4在慢性髓系白血病進(jìn)展及耐藥

5、中的作用機制
　　 方法:1.臨床水平檢測:經(jīng)知情同意，收集慢性髓系白血病患者骨髓原始細(xì)胞，其中慢性期12例，進(jìn)展期9例，使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心方法分離單個核細(xì)胞，TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，Q-PCR方法檢測各個臨床標(biāo)本中EphB4的mRNA表達(dá)水平。蛋白裂解液提取總蛋白質(zhì)，以β-actin為內(nèi)參，Westernblot方法檢測各個臨床標(biāo)本中EphB4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

6、
　　 2.細(xì)胞水平檢測:分別培養(yǎng)野生型K562細(xì)胞株和耐伊馬替尼的K562-R細(xì)胞株，于細(xì)胞生長對數(shù)期收集細(xì)胞，TRIzol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，Q-PCR方法檢測各個細(xì)胞株中EphB4的mRNA表達(dá)水平。蛋白裂解液提取總蛋白質(zhì)，以β-actin為內(nèi)參，Westernblot方法檢測細(xì)胞株中EphB4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　 3.RNAi干擾EphB4的表達(dá)水平
　　 ①EphB4慢病毒干擾載體的構(gòu)建

7、:RNA干擾序列于ABI在線軟件自行設(shè)計，共設(shè)計三條干擾序列和一條對照序列(shRNA1，shRNA2，shRNA3，shRNAcontrol)，委托上海invitrogen公司化學(xué)合成。慢病毒載體為lentilox3.7(pLL3.7)，經(jīng)Hpa(I)及Xho(I)內(nèi)切酶將載體線性化后分別將四條備用的序列與載體連接，次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并挑取單菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，委托廣州贏森公司測序鑒定。
　　 ②效率載體的篩選:將構(gòu)建好

8、的載體經(jīng)脂質(zhì)體包裝后分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時熒光顯微鏡觀察，提取RNA和總蛋白，分別使用Q-PCR和WB方法檢測EPHB4的表達(dá)情況，選擇干擾效率最高的載體進(jìn)行包裝。
　　 ③慢病毒包裝:選擇干擾效率最高的包裝質(zhì)粒pll3.7-EphB4-shRNA2進(jìn)行質(zhì)粒大提，聯(lián)合兩個包膜質(zhì)粒p-CMV-VSV-G，p-CMV-dr8.9共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞，6小時換液，72小時收集上清，4000g離心5分鐘，0.45um濾膜過

9、濾，-80度保存。
　　 ④穩(wěn)定干擾EphB4的K562-R細(xì)胞株的建立:使用病毒液感染K562-R細(xì)胞，96小時熒光鏡下觀察，使用流式細(xì)胞儀分選出帶有熒光的細(xì)胞后繼續(xù)擴大培養(yǎng)，Q-PCR及Westernblot方法檢測EphB4的表達(dá)水平變化，并命名為K562-R-EphB4-shRNA。
　　 4.K562-R-EphB4-shRNA細(xì)胞的生物學(xué)特性分析:
　　 ①藥物耐受性分析:CCK-8法檢測K562、K

10、562-R-EphB4-shRNA，K562-R細(xì)胞對梯度濃度伊馬替尼的耐藥性，通過計算細(xì)胞抑制率，得出各自IC50值，并行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 ②細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡分析:分別以梯度濃度伊馬替尼處理K562，K562-R-EphB4-shRNA，K562-R細(xì)胞，APC-AAD試劑、PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀方法檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分析，并行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 5.EphB4對下游信號分子表達(dá)的影響
　　 ①基因芯

11、片分析K562-R-EphB4-shRNA細(xì)胞株與K562-R細(xì)胞株的表達(dá)譜差異，并分析差異基因及所涉及的主要信號通路。
　　 ②數(shù)據(jù)挖掘方法分析CML耐藥發(fā)生所參與的信號通路。將其與我們前期得到的信號通路比較，得出參與耐藥較為重要的CMLIM信號通路。
　　 ③在信號通路中找出表達(dá)變化的基因，得出EphB4可能調(diào)控的分子并進(jìn)行初步驗證。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)分析:用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理，P＜0.05表示差

12、異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.EphB4在12例CMLIM耐藥原代細(xì)胞的表達(dá)水平高于CMLIM敏感骨髓原代細(xì)胞，二者具有顯著性差異(P=0.000)。EphB4蛋白在4例CMLIM耐藥原代細(xì)胞中的表達(dá)水平高于CMLIM敏感細(xì)胞(P=0.000)。
　　 2.EphB4在IM耐受的K562-R細(xì)胞的表達(dá)水平高于野生型K562細(xì)胞，二者具有顯著性差異(P=0.000)。
　　 3.測序后證實目的片段均連接成功，經(jīng)

13、篩選，shRNA2為干擾效率較高的包裝載體。K562-R細(xì)胞經(jīng)慢病毒感染及流式細(xì)胞儀分選后測定GFP陽性率為80％，Q-PCR和WB檢測EPHB4在細(xì)胞中穩(wěn)定低表達(dá)，K562-R-EphB4-sh穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞株建立。
　　 4.CCK8法檢測K562-R-EphB4-sh細(xì)胞對于伊馬替尼的敏感性部分恢復(fù)，其IC50(IC500.7228±0.04752μM)較K562-R細(xì)胞(IC502.8101±0.04674μM)下降，但

14、其敏感性仍低于野生K562細(xì)胞(IC500.1207±0.0234μM)，三組IC50值有顯著性差異(P=0.000)。
　　 5.細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)相同濃度相同時間伊馬替尼處理后，K562-R-EphB4-sh細(xì)胞G2/M期比例較K562-R細(xì)胞增加，但仍低于野生型K562細(xì)胞。
　　 6.細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)相同濃度相同時間伊馬替尼處理后，K562-R-EphB4-sh細(xì)胞的凋亡率較K562-R細(xì)胞增加，但仍低于野

15、生型K562細(xì)胞。
　　 7.綜合文獻(xiàn)復(fù)習(xí)、基因芯片及生物信息學(xué)分析，我們得出了EphB4致IM耐藥的可能機制:首先，EphB4可能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)BCR-ABL下游信號分子RAS/MEK/ERK使得CML細(xì)胞增殖失控凋亡受阻，其次，EphB4可能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)非BCR-ABL下游的信號分子MLCP、VAV1等來調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架遷移變化，再次，EphB4可能通過與細(xì)胞膜整合素分子ITGA/ITGBcrosstalk增強細(xì)胞間的相互粘附，導(dǎo)致細(xì)

16、胞粘附異常，這些因素共同引發(fā)EphB4相關(guān)的CMLIM耐藥。
　　 結(jié)論:EphB4在CMLIM耐藥的骨髓原代細(xì)胞中的表達(dá)較敏感細(xì)胞中的升高，在K562-R細(xì)胞中的表達(dá)較K562細(xì)胞升高。EphB4敲除后，K562-R細(xì)胞對于IM的敏感性部分恢復(fù)。EphB4致IM耐藥機制為BCR-ABL非依賴性，一方面可能通過持續(xù)激活BCR-ABL下游信號分子致IM耐藥，另一方面，可能通過與細(xì)胞膜整合素分子ITGA/ITGBcrosstalk和