四乙胺絡(luò)合鐵蛋白亞基質(zhì)譜特性和誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、大量研究指出,鐵蛋白主要生理功能是釋放鐵給細(xì)胞,合成含鐵的酶蛋白,儲(chǔ)存細(xì)胞中的過量鐵,避免產(chǎn)生鐵中毒現(xiàn)象。哺乳動(dòng)物鐵蛋白由H和L亞基組成,其中H亞基負(fù)責(zé)絡(luò)合亞鐵離子和氧化亞鐵形成高鐵組分,L亞基負(fù)責(zé)鐵核形成與礦化。有關(guān)鐵蛋白亞基類型、亞基之間的相互作用強(qiáng)度和執(zhí)行新生理功能還存在著爭議。本文以豬胰臟鐵蛋白(pig pancreas ferritin,PPF)為實(shí)驗(yàn)材料,優(yōu)化鐵蛋白分離技術(shù),小批量制備高純度的PPF。選用SDS-PAGE方法

2、分析了PPF由H(21.0kDa),L亞基(19.0 kDa)和SH(small H subunits)小亞基組成。選用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF MS)直接分析PPF中含有不穩(wěn)定的H和SH亞基,其中L-L、H-L、L-SH和H-SH亞基之間的相互作用強(qiáng)度較高。采用反相高壓液相色儀(RP-HPLC)技術(shù)也發(fā)現(xiàn),PPF由H、L和少量SH亞基組成,推算L/H亞基之間的比值約為2:1。采用MALDI-TOF

3、 MS技術(shù)分析PPF中不穩(wěn)定的H和SH亞基,其分子量分別為20135.015 Da和12925.221 Da。采取混合基質(zhì),增強(qiáng)質(zhì)譜儀的激光強(qiáng)度和提高反應(yīng)介質(zhì)酸度等措施,MALDI-TOFMS技術(shù)獲得PPF對應(yīng)4個(gè)亞基質(zhì)譜峰,其m/z值分別為9981.82,10649.16,19960.71和20835.96 Da,對應(yīng)的亞基分子式為[M2+]L、[M2+]H、[M+]L和[M+]H,但未獲得SH亞基的質(zhì)譜信息,說明PPF亞基之間的相互

4、作用強(qiáng)度,穩(wěn)定性隨亞基結(jié)構(gòu)的變化而變化。分別采用ESI-Q-TOF MS技術(shù)和RP-HPLC-ESI-Q-TOF MS分別鑒定PPF亞基類性、相互作用強(qiáng)度和計(jì)算它們同源性信息。酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與野豬相比,其H和L亞基同源性分別達(dá)到85％和100％(部分序列),并同樣發(fā)現(xiàn)PPF中的部分H亞基不穩(wěn)定,易被解離成準(zhǔn)亞基離子,供質(zhì)譜分析。
　　 鉀離子通道阻滯劑四乙胺(TEA)和四氨基吡啶(4-AP)均能高效阻斷細(xì)胞膜上的鉀離子通道。

5、TEA直接絡(luò)合于鐵蛋白H亞基上,形成PPFH-TEA復(fù)合物,未發(fā)現(xiàn)絡(luò)合于L亞基的PPFL-TEA復(fù)合物。選用化學(xué)強(qiáng)還原劑Na2S2O4和生物還原劑Vc,分別研究PPF釋放鐵的動(dòng)力學(xué)全過程,指出PPF釋放鐵的全過程可分為快速釋放鐵(一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué))和慢速釋放鐵(零級反應(yīng)動(dòng)力學(xué))的過程。其變化趨勢和規(guī)律與PPFH-TEA復(fù)合物釋放鐵全過程很相似。
　　 TEA和4-AP也能阻斷癌癥細(xì)胞細(xì)膜上的鉀離子通道,從而起到抑制細(xì)胞生長效果。紫

6、杉醇、TEA和4-AP抑制腫瘤細(xì)胞生長已有詳細(xì)的研究報(bào)道,但用于分別或協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長或揭示其凋亡分子機(jī)制的研究報(bào)道甚少。本論文選用MTT、單染/雙染流式細(xì)胞術(shù)分別研究誘導(dǎo)人宮頸癌(Hela)細(xì)胞凋亡速率和變化趨勢,證實(shí)了這三種抑制劑能協(xié)同增強(qiáng)抑制Hela細(xì)胞凋亡速率,且死亡的主要原因?yàn)榧?xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。運(yùn)用細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在全細(xì)胞模式下測定Hela細(xì)胞膜上的鉀電流,在TEA處理組中,電流抑制率高達(dá)80％。MALDI-TOF MS技

7、術(shù)證實(shí)TEA能改變Hela細(xì)胞膜表層的多肽分布與組成,可能是TEA能誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)差異蛋白質(zhì)或多肽。選用順鉑-人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡過程中所表達(dá)的26種差異蛋白質(zhì)為目標(biāo)蛋白,設(shè)計(jì)對應(yīng)的引物,研究在TEA和4-AP分別誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡過程中所產(chǎn)生mRNA表達(dá)情況與趨勢,并發(fā)現(xiàn)這26種蛋白質(zhì)均得到差異表達(dá),可見TEA和4-AP類似其他抗腫瘤藥物,均通過相同或相似的途徑和機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 選用蛋白質(zhì)組學(xué)

8、及相關(guān)分析技術(shù)篩選與鑒定出TEA誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡過程中的差異蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)33個(gè)蛋白表達(dá)量上存在顯著的差異,其中13個(gè)蛋白表達(dá)量上調(diào),20個(gè)蛋白表達(dá)量下調(diào)。差異蛋白質(zhì)涉及ATP結(jié)合,分子伴侶,酶的活性,鉀鈣離子結(jié)合,細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn),氧化還原平衡,代謝等多種分子生物功能,通過差異蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),TEA主要的靶向位點(diǎn)為細(xì)胞質(zhì)蛋白。選用IngenuityIPA軟件分析得到差異蛋白涵蓋細(xì)胞移動(dòng),腫瘤形成,細(xì)胞發(fā)育等蛋白網(wǎng)絡(luò)。此外采用weste

9、rn-blotting分析谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTO1)差異蛋白的表達(dá)水平,其表達(dá)量隨TEA濃度遞增而降低。Real-time PCR分析Hela表達(dá)的33種差異蛋白所對應(yīng)的mRNA水平、變化趨勢和規(guī)律基本上與2D-PAGE分離膠中蛋白質(zhì)表達(dá)量相似。這些結(jié)果進(jìn)一步佐證了采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選的由TEA誘導(dǎo)Hela細(xì)胞表達(dá)的差異蛋白的可靠性,揭示TEA不僅阻斷Hela鉀離子通道,而且在蛋白合成的過程中,通過影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,誘導(dǎo)腫瘤