宮頸癌蛋白質(zhì)質(zhì)譜變化研究.pdf

1、1 目的 為了能夠建立用于宮頸癌和癌前病變的診斷與宮頸癌篩查的血清蛋白質(zhì)組合，進(jìn)一步了解宮頸癌的發(fā)生機(jī)制，本研究采用SELDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)宮頸癌與健康女性的血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜變化進(jìn)行研究，進(jìn)行差異表達(dá)的蛋白質(zhì)篩選，然后在宮頸癌前病變患者、宮頸癌行廣泛子宮切除加盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)后以及其后進(jìn)行隨訪的患者血清中，進(jìn)行同組蛋白質(zhì)含量的凇驗(yàn)，以了解它們?cè)跓o(wú)瘤-有瘤一無(wú)瘤生存模式全過(guò)程中的變化，以期篩選出能夠監(jiān)測(cè)宮頸癌全過(guò)程的蛋白質(zhì)組合

2、，如宮頸癌的早期診斷、治療效果的評(píng)價(jià)以及預(yù)后的評(píng)估。 2 材料與方法 2.1研究對(duì)象 樣本來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，入選要求：病理資料完整，無(wú)放療或化療等針對(duì)宮頸癌的治療。 2.1.1血清標(biāo)本①宮頸癌49例，其中鱗癌45例(91.84％)，腺癌4例(8.16％)；FIGO分期Ⅰ b-Ⅱ a期39例(79.59％)，Ⅱ a期以上lO例(20.41％)。中位年齡47歲(25歲-75歲)。以及年齡相配的健康女性

3、71例。②宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intra-epithelial neoplasia，CIN)67例，其中CIN Ⅰ-Ⅱ級(jí)35例， CIN Ⅲ級(jí)32例。③宮頸癌Ⅰ b-Ⅱa期行廣泛子宮切除和盆腔淋巴結(jié)清掃手術(shù)后10天者24例，術(shù)后3月復(fù)診者22例，術(shù)后1年隨訪者18例。 2.1.2組織標(biāo)本宮頸癌組織33例，正常宮頸上皮組織29例。 2.2標(biāo)本收集 2.2.1血清標(biāo)本清晨空腹靜脈血3ml，靜置30min

4、，2000rpm，離心20min，每管100μl分裝，-80℃冰箱保存。 2.2.2組織標(biāo)本宮頸癌行廣泛子宮全切加盆腔淋巴結(jié)清掃手術(shù)，標(biāo)本離體后立即剖開(kāi)宮頸，清理宮頸黏液，靠近癌組織基底部取材，同時(shí)在距癌組織邊緣≥1cm處選取正常宮頸上皮，初步切碎后用0.25％胰蛋白酶消化30分鐘，Hank's液沖洗，900rpm離心10min，去除上清夜，重復(fù)沖洗離心共3次，行細(xì)胞涂片常規(guī)病理檢查，同時(shí)行細(xì)胞記數(shù)，要求目標(biāo)細(xì)胞(正常宮頸上皮細(xì)

5、胞或?qū)m頸癌細(xì)胞)≥85％，細(xì)胞計(jì)數(shù)1×10<'7>/ml，做好標(biāo)記，置于-80℃保存。 2.3研究方法 2.3.1芯片準(zhǔn)備將IMAC-Cu芯片(immobilized metal affinity capture arrays-Cu，IMAC-Cu)置于操作平臺(tái)，每孔加50 μl 100mmol/L硫酸銅，振蕩5min，倒除硫酸銅，去離子水沖洗5次，甩干；每孔中加入50 μl的100mmol/L醋酸鈉(PH4.0)使之中

6、和，振蕩5min，去離子水沖洗5次，甩干；每孔加入結(jié)合緩沖液150μl(pH7.0)使之平衡，振蕩器震蕩5min后除去緩沖液，重復(fù)一次。 2.3.2血清樣本的處理樣本冰盒上融化，以10μl血清加20μl(1：2)的比例加入U(xiǎn)9緩沖液混勻，4℃震蕩30min，使蛋白質(zhì)變性，取10μl變性后的樣品加120μl的結(jié)合緩沖液，4℃震蕩30min備用。 2.3.3組織樣本處理樣本冰盒上融化，加入50μl細(xì)胞裂解液，4℃震蕩30mi

7、n，15 000rpm，4℃離心10min，取上清夜20μl，以1：2的比例加入U(xiǎn)9緩沖液，4℃震蕩30min，使蛋白質(zhì)變性，取10μl變性后的樣品加120μl的結(jié)合緩沖液，4℃震蕩30min備用。 2.3.4蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)在處理好的芯片中每孔加入50μl處理好的樣品(血清/組織)，4℃震蕩60min；每孔加入150μl結(jié)合緩沖液，振蕩5min，棄去緩沖液，重復(fù)操作一次；每孔分兩次加入能量吸收分子飽和溶液，每次0.5μl，兩次之

8、間允許各孔風(fēng)干。 2.3.5數(shù)據(jù)收集和生物信息學(xué)處理將芯片放入質(zhì)譜閱讀儀檢測(cè)，在ProteinChip software(Ciphergen，Inc)支持下，設(shè)定讀片程序。在樣本芯片閱讀檢測(cè)前，用加有All-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，使分子量檢測(cè)誤差<0.1％，再以質(zhì)控蛋白芯片做重復(fù)性檢測(cè)，質(zhì)譜峰值強(qiáng)度(高度)的變異系數(shù)控制在15％以下。設(shè)定SELDI-TOF-MS激光強(qiáng)度為170，診斷率為6，優(yōu)化分子量范

9、圍為2 000-20 000Da，最高分子量為50，000Da，行低、高能量?jī)纱螜z測(cè)，平均收取90個(gè)激光點(diǎn)。利用Biomarkerr Wizard Software(類(lèi)似統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件)進(jìn)行噪音過(guò)濾以及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)峰平均強(qiáng)度值做組間t檢驗(yàn)，得出該蛋白質(zhì)在兩樣本之間表達(dá)的差異。采用Biomarker Patterns Software(數(shù)據(jù)挖掘軟件)建立決策樹(shù)分類(lèi)模型，即：將初步篩選出的蛋白質(zhì)質(zhì)譜信息資料輸入這個(gè)軟件系統(tǒng)

10、，軟件讀取，建立最大決策樹(shù)分類(lèi)模型及源于該模型的較小決策樹(shù)，決策樹(shù)會(huì)依據(jù)質(zhì)譜峰強(qiáng)度的不同將樣本分到不同的兩個(gè)節(jié)點(diǎn)內(nèi)，而后每一個(gè)節(jié)點(diǎn)內(nèi)的樣本又會(huì)根據(jù)一個(gè)新的質(zhì)譜峰的強(qiáng)度值再分類(lèi)，當(dāng)一個(gè)樣本中的質(zhì)譜峰強(qiáng)度小于或等于這個(gè)選定的閾值時(shí)，就被分到左邊的節(jié)點(diǎn)內(nèi)，否則分到右側(cè)，直到所有輸入的樣本都被分到終節(jié)點(diǎn)為止，進(jìn)入模型分類(lèi)時(shí)錯(cuò)誤率最低的質(zhì)譜峰被選為分類(lèi)變量。用10倍交叉驗(yàn)證(10-fold cross validation)方法對(duì)決策樹(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，

11、找出錯(cuò)誤率最低的決策樹(shù)分類(lèi)模型，同時(shí)得到該分類(lèi)模型對(duì)樣本的診斷率(敏感度)和排除率(特異度)。 2.3.6差異表達(dá)蛋白質(zhì)的t檢驗(yàn)將從宮頸癌患者與健康女性血清中篩選出的具有分類(lèi)意義的差異表達(dá)蛋白質(zhì)作為一組，同其從CIN Ⅰ-Ⅱ級(jí)、CIN Ⅲ級(jí)、宮頸癌手術(shù)治療后以及其后隨訪各組的SELDI-TOF-MS檢測(cè)中得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)(SPSS 11.0) 結(jié)論 4.1 宮頸癌和健康對(duì)照組血清蛋白質(zhì)資料分析 質(zhì)

12、荷比為M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的一組蛋白質(zhì)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，在宮頸癌患者血清中低表達(dá)，推測(cè)它們可能是正常宮頸上皮的具有生理功效的一組蛋白質(zhì)或多肽，也可能是一組重要的保護(hù)因素或抑癌因子。這組蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，反映了宮頸癌的重要特征性分子學(xué)改變，有可能成為與宮頸癌相關(guān)的重要生物學(xué)標(biāo)記物。 4.2 宮頸癌前病變組血清蛋白質(zhì)資料分析 質(zhì)荷比為

13、M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06，M9280.63的一組蛋白質(zhì)含量,由正常對(duì)照、CIN Ⅰ-Ⅱ級(jí)、CIN Ⅲ級(jí)到宮頸癌，依次依P<0.01水平降低，推測(cè)它們與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，驗(yàn)證了它們可能是正常宮頸上皮的具有生理功效的一組蛋白質(zhì)或多肽，也可能是一組重要的保護(hù)因素，或抑癌因子。提示：經(jīng)過(guò)更多的資料補(bǔ)充和研究后可成為用于宮頸癌前病變的篩選以及宮頸癌早期診斷的一組生物學(xué)指標(biāo)。

14、 4.3 宮頸癌術(shù)后及隨訪組血清蛋白質(zhì)資料分析 質(zhì)荷比為M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06和9280.63的一組蛋白質(zhì)，其含量在宮頸癌手術(shù)治療后逐漸回升，在手術(shù)后1年內(nèi)的時(shí)間里基本恢復(fù)至正常水平，提示：經(jīng)過(guò)大樣本隨訪資料補(bǔ)充和宮頸癌治療后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移患者此組血清蛋白質(zhì)含量的比較研究，有可能成為制定宮頸癌治療方案的依據(jù)、評(píng)價(jià)宮頸癌治療效果以及判斷預(yù)后使用的一組生物學(xué)指標(biāo)。

15、 4.4宮頸癌組織與正常宮頸上皮組織資料分析 利用SELDI-TOF-MS技術(shù)從宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織中篩選出的具有分類(lèi)意義的8種蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究以及與宮頸癌血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)共同應(yīng)用，有可能篩選出更為簡(jiǎn)單實(shí)用能夠應(yīng)用于臨床的免疫組化指標(biāo)。 4.5本研究資料的綜合分析 質(zhì)荷比為M8929.31，M7930.52，M9127.31，M8141.01，M7963.06和9280.63的一組蛋白質(zhì)，其

16、血清含量由健康女性、CIN Ⅰ-Ⅱ級(jí)、CIN Ⅲ級(jí)到宮頸癌，依次依P<0.01水平降低，至宮頸癌時(shí)降低到最低水平，在宮頸癌手術(shù)治療后逐漸回升，在手術(shù)后的1年時(shí)間里基本恢復(fù)至正常水平。撇開(kāi)它們?cè)趯m頸癌分子水平研究中的作用與地位，如果經(jīng)濟(jì)允許，可將它們從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中查出對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白質(zhì)檢測(cè)與鑒定，同時(shí)進(jìn)行大樣本的測(cè)試，并增加宮頸癌治療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者此組血清蛋白質(zhì)的監(jiān)測(cè)，以及進(jìn)行生存資料的完善與補(bǔ)充，相信能夠?qū)⒈狙芯?/p>