長角血蜱的形態(tài)學(xué)鑒定與保護(hù)性抗原基因（P27-30）的克隆與原核表達(dá).pdf

1、長角血蜱是我國的重要危害蜱種，廣泛分布于17個省區(qū)，傳播多種病原體。該蜱對畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的同時，對公共安全也造成了一定的威脅。本研究對采自四川地區(qū)光鏡下疑似長角血蜱的蜱用掃描電鏡對其各期蟲體及蟲卵進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果：雌成蜱的口下板齒式4 | 4或4-5 | 5-4，多孔區(qū)小孔30～35個，兩多孔區(qū)的間距為孔區(qū)長徑的2倍，氣門板”D”字狀，肛毛5對；若蜱齒式2-3 | 3-2，須肢第3節(jié)背面后緣無刺，無多孔區(qū)和生殖孔，氣門板亞

2、圓形，無氣門斑，肛毛3對；幼蜱齒式2 | 2，無氣門板，肛毛1對，無肛后溝，爪墊明顯超過爪長的2/3。各期蟲體的哈氏器結(jié)構(gòu)基本相同，但成蜱前窩內(nèi)感毛7根，而若蜱、幼蜱均為6根。卵表面光滑無特殊結(jié)構(gòu)。首次觀察到長角血蜱成蜱氣門板腹面前方有7、8個小孔，肛瓣下方有密集成帶的小刺以及十幾個氣孔樣物。掃描電鏡觀察結(jié)果結(jié)合該蜱的生物學(xué)特性，確定該蜱為長角血蜱的孤雌生殖類群。 為了進(jìn)行抗蜱疫苗的研究，參照長角血蜱日本株報道的保護(hù)性抗原基因P

3、27/30的核苷酸序列設(shè)計了1對特異性引物。用該引物對實驗室飼養(yǎng)的饑餓成蜱的總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到約670BP的目的片段。回收目的片段并克隆到PMD18-T載體上，序列測定結(jié)果顯示本次實驗首次擴(kuò)增出了中國株長角血蜱的P27/30基因。擴(kuò)增的序列中包含P27/30基因完整的開方閱讀框，編碼由201個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。軟件分析表明中國株與日本株該基因同源性高達(dá)99.85％，只在第239位的堿基出現(xiàn)了a-g顛換，而且相應(yīng)氨基酸沒

4、有發(fā)生改變。用分別帶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點的特異性上，下游引物對陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行了亞克隆。將亞克隆陽性質(zhì)粒和空載體PET32a(+)分別雙酶切后，進(jìn)行連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體PET32a(+)-P27/30，測序結(jié)果顯示從起始密碼子到終止密碼子堿基序列沒有出現(xiàn)移碼，沒有基因突變，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。將陽性表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E. coliBL21(DE<,3>)進(jìn)行表達(dá)研究，SDS-PAGE電泳顯示在37℃，1mmol/L的IPT