長角血蜱HL-3和HL-4功能基因的克隆及鑒定.pdf

1、長角血蜱(Haemaphysalis longicornis)作為一種專性吸血外寄生蟲,是許多細(xì)菌、病毒、原蟲及立克次氏體等病原體的傳播媒介之一,影響人類和家畜的健康,嚴(yán)重制約著我國畜牧業(yè)的發(fā)展,引起重大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的化學(xué)藥物防控雖然在一定程度上對(duì)蜱起到了防控作用,但是蜱耐藥性及環(huán)境污染等問題的出現(xiàn)使得研究新的生物防控途徑成為蜱防控的必然趨勢。近年來以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的疫苗防控為人們研制生物抗蜱疫苗提供了新的思路,而這一途徑的關(guān)鍵在于蜱

2、功能分子的鑒定。本研究采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)對(duì)文庫中篩選到的未知基因進(jìn)行擴(kuò)增,獲得了目的基因的全長序列,隨后進(jìn)行克隆和表達(dá),分析其分布及生物學(xué)功能,評(píng)估其作為控蜱疫苗候選抗原的可行性,從而為研制抗蜱生物疫苗奠定理論基礎(chǔ)。
　　 采用5'RACE技術(shù)擴(kuò)增得到了長角血蜱酸性磷酸酶(HL-3)基因的5'端未知序列,通過DNAStar拼接首次獲得了長角血蜱酸性磷酸酶的全長序列。該基因全長1324 bp,含有1137 b

3、p完整的開放式閱讀框(ORF),編碼378個(gè)氨基酸,預(yù)測的分子量約42.4 kDa,等電點(diǎn)(pI)為6.35。生物信息學(xué)分析表明,該序列含有3個(gè)糖基化位點(diǎn)、一個(gè)信號(hào)肽和多個(gè)磷酸化位點(diǎn),此外以人的前列腺酸性磷酸酶為模板構(gòu)建了該蛋白的空間三維結(jié)構(gòu)。將該序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中,獲得了登錄號(hào)HM150759。將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1／HL-3置于大腸桿菌中進(jìn)行大量表達(dá),通過Westernblotting分析該基因顯示出很好的反應(yīng)原

4、性。酶活性分析表明該酶在pH5.0時(shí)水解對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pNPP)的能力最強(qiáng)。Real-time PCR分析結(jié)果表明:該基因在長角血蜱的不同發(fā)育階段均表達(dá),且在半飽血時(shí)期表達(dá)量明顯上調(diào)；組織分布表明該基因在部分飽血長角血蜱中腸中的表達(dá)豐度明顯高于卵巢和唾液腺；LPS注射和瑟氏泰勒蟲感染能誘導(dǎo)長角血蜱成蜱HL-3基因表達(dá)量顯著性上調(diào)。這些結(jié)果表明該基因可能與蜱的發(fā)育、吸血、血液消化和蜱的天然免疫相關(guān)。免疫印記分析表明天然蛋白HL-3在長

5、角血蜱各階段都存在。動(dòng)物免疫試驗(yàn)及RNAi實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該蛋白對(duì)蜱的體重及死亡率有一定影響,其他生理指標(biāo)不明顯。
　　 采用5'RACE和3'RACE擴(kuò)增技術(shù)在已知序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增,測序拼接后得到了1428 bp的長角血蜱的Ras激酶抑制(KSR)錯(cuò)誤表達(dá)抑制基因(HL-4)的全長序列。該基因含有一個(gè)1185 bp完整的ORF,編碼395個(gè)氨基酸,預(yù)測的分子量為44.57 kDa,等電點(diǎn)(pI)約6.21。生物信

6、息學(xué)分析表明,該序列含有5個(gè)糖基化位點(diǎn),沒有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,是一種膜外蛋白。將該序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中,獲得了登錄號(hào)HM195183。將目的基因連至表達(dá)載體pGEX-4T-1中進(jìn)行原核克隆表達(dá),Western blotting分析表明該基因具有很好的反應(yīng)原性。Real-time PCR分析表明,該基因在長角血蜱不同發(fā)育階段中均表達(dá),且在半飽血階段表達(dá)量升高；在部分飽血蜱中,HL-4基因在卵巢和唾液腺中的表達(dá)量明顯高于中腸;