痹腫消湯干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜病變的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的： (1)研究膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen．induced arthritis，CIA)大 鼠滑膜組織蛋白質(zhì)表達，探討類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rlmurtmtoid arthritis，RA)的發(fā)病機制； (2)分析痹腫消湯(Bizhongxiao decoction，BZXD)干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜病變的差異蛋白質(zhì)表達，探討痹腫消湯治療RA的作用機理。 方法： (1)采用牛Ⅱ型膠原(bovin

2、eⅡ collgen,BⅡC)混合完全弗氏佐 劑(complete Freund's adjuvant,CFA)皮下注射大鼠復(fù)制實驗性關(guān)節(jié)炎動物模型。模型成功后隨機分為兩組，一組為痹腫消湯組(n=30，簡稱治療組)，灌服BZXD，另一組為CIA模型組(n=30，簡稱模型組)，灌服等劑量雙蒸水。正常對照組(簡稱正常組，n=30)大鼠不作處理。 (2)觀察三組大鼠一般情況、關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分、足爪腫脹度、病理形態(tài)學(xué)改變。在免疫后第10

3、天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天分別記錄大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分；每周測體重及足爪腫脹程度；在免疫后第25天、35天、45天分批處死大鼠，用HE染色法觀察各組踝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)改變。 (3)應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis，2DE)分別分離正常組、模型組及治療組大鼠不同時間膝關(guān)節(jié)滑膜總蛋白，膠體考染顯色，Image Scan對膠體考染的2-DE膠掃描以

4、獲取電子圖像，Pdquest7.2圖像分析軟件比較分析此三組不同時間雙向凝膠電泳圖譜并識別差異表達的蛋白質(zhì)。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption／ionization time-of-flight mass spectrometry，MAI,DI-TOF-MS)得到相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptide mass fingerprinlt,PMF)，然后搜索數(shù)據(jù)庫鑒定

5、部分差異蛋白質(zhì)點，運用western blotting方法驗證差異表達蛋白。 結(jié)果： 1．CIA模型復(fù)制：采用BIIC混合CFA皮下注射SD大鼠成功復(fù)制CIA模型，成功率達88.6％。 (1)一般情況觀察：模型組大鼠精神欠佳，飲食減少，平均體重較治療組輕(P<0.05)，體毛欠光澤，后期可見毛發(fā)枯燥，治療組未見以上情況。模型組大鼠于免疫后第3周、第4周、第5周、第6周體重增長較正常組緩慢(P<0.05)，第1周和

6、第2周體重增長差異無顯著性(P>0.05)；治療組大鼠于第5、6周體重增長較模型組明顯，差異有顯著性(P<0.05)，其余時間點差異不顯著。 (2)關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分評定：CIA大鼠關(guān)節(jié)炎體征于免疫后8-l0天開始出現(xiàn)。免疫后10d，模型組，治療組的關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分增加。模型組于免疫后25天關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分達到高峰，30天開始下降；治療組大鼠A工積分與模型組比較，在20天前無明顯區(qū)別，差異無顯著性(P>0.05)，于25天左右達高峰，但

7、仍較模型組低，差異有顯著性(P<0.05)。BZXD治療兩周后，關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分開始下降。治療組大鼠AI積分于20天、30天、35天、40天、45天均明顯低于模型組(P<0．05)。 (3)足爪腫脹度測量：模型組大鼠于免疫后第2周、第3周、第4周、第5周、第6周足爪腫脹較正常組明顯(P<0.05)；治療組大鼠于第5周、第6周足爪腫脹較模型組減輕(P<0.05)，其余時間點差異無顯著性。(4)病理組織學(xué)觀察：正常大鼠滑膜組織未見明顯

8、的新生血管及炎癥細胞浸潤，模型組25天有明顯血管增生、滑膜增厚，炎性細胞浸潤、水腫，隨著關(guān)節(jié)癥狀的加重，新生血管逐漸增多、血管擴張、充血，大量淋巴細胞浸潤。治療組滑膜組織可見少量新生血管及炎癥細胞浸潤，滑膜輕度增厚，于35d后可見新生血管減少，炎癥減輕，滑膜變薄。痹腫消湯能減輕cIA關(guān)節(jié)滑膜損傷。 2．關(guān)節(jié)滑膜組織雙向凝膠電泳圖譜的建立和圖象分析： 建立了正常組、模型組和治療組關(guān)節(jié)滑膜的雙向凝膠電泳圖譜。 在相同

9、的設(shè)定值時檢測到蛋白質(zhì)點數(shù)分別為：正常組947±39個，模型組25天、35天、45天分別為1019±22、1070±44、994±41個，治療組25天、35天、45天分別為1008±28、1053±24、1031±52個。經(jīng)過背景消減后，分別將其中的一塊膠作為參考膠進行3塊膠間的蛋白質(zhì)點的匹配，結(jié)果得到正常組的平均匹配點數(shù)為871±35個，模型組25天、35天、45天分別為910±20、959±39、905±37個，治療組25天、35天

10、、45天分別為884±24、953±22、971±49個，其平均匹配百分率分別為92％、89.3％、89.6％、91％、87.7％、90.5％、94.2％。不同膠間蛋白質(zhì)點在等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)方向的偏差是0.896±0.217mm，在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdo-decylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PA．GE

11、)方向的偏差為1-102±0.104ram。 3．各組2-DE圖譜差異點分析： 比較分析三組滑膜2-DE圖譜，模型組25天與正常組之間有380個差異點，44個在模型組表達上調(diào)，336個表達下調(diào)。治療組25天與模型組25天之間有290個差異點，189個在治療組表達上調(diào)，101個表達下調(diào)。模型組35天與正常組之間有284差異點，180個在模型組表達上調(diào)，104個表達下調(diào)；治療組35天與模型組35天之間有205個差異點，52個在治療

12、組表達上調(diào)，153個表達下調(diào)。模型組45天與正常組之間有193個差異點，123個在模型組表達上調(diào)，70個表達下調(diào)；治療組45天與模型組45天之間有328個差異點，174個在治療組表達上調(diào)，147個表達下調(diào)，7個蛋白質(zhì)點只在模型組表達。 4．差異蛋白質(zhì)點質(zhì)譜鑒定及蛋白功能分類： 發(fā)現(xiàn)并鑒定了正常組、CIA模型組和治療組大鼠滑膜的差異表達大于2倍的蛋白質(zhì)點55個。根據(jù)NCBI、MSDB數(shù)據(jù)庫中提供的的信息，這些差異蛋白質(zhì)的功

13、能涉及物質(zhì)代謝、能量產(chǎn)生、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、抗氧化應(yīng)激、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細胞骨架等。其中g(shù)elsolin、lamin A、annexin 1、annexin V、peroxiredoxin 1、peroxiredoxin 2、peroxiredoxin 6、catalase、apolipoprotein A-I、aldolase A、glyceraldehyde 3-phosphate dehydrog-enase、phosphoglycerate

14、kinase、Rho A、preprohaptoglobin等蛋白可能與CIA滑膜病變密切相關(guān)。5．差異蛋白驗證結(jié)果： (1)造模25天后，模型組annexin V表達與正常組相比開始下調(diào)(P<0.05)，治療組annexin V表達強于模型組(P<0.05)；隨著免疫時間的延長，模型組annexin V表達逐漸降低(P<0.05),治療組則逐漸增強(P0.05)。 (2)造模25

15、天后，模型組adolase A表達與正常組比較開始上調(diào)(P<0.05)，治療組adolase A表達低于模型組(P<0.05)；隨著免疫時間的延長，模型組adolaseA表達逐漸上調(diào)(P<0.05)，治療組則逐漸降低(P<0.05)，接近于正常組adolase A表達水平。Western bloRing方法證實annexin V、adolase A在正常組、模型組、治療組的表達水平與2DE結(jié)果一致。 結(jié)論： (1)以BI

16、IC混合CFA皮下注射SD大鼠成功復(fù)制了CIA動物模型，該模型具有RA代表性特點，可作為RA研究用。 (2)建立了CIA大鼠模型關(guān)節(jié)滑膜的雙向凝膠電泳圖譜，鑒定了55個差異表達蛋白質(zhì)，提示RA模型關(guān)節(jié)滑膜病變是一個多蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜過程。痹腫消湯可調(diào)節(jié)RA大鼠滑膜組織多種蛋白質(zhì)表達，提示該方藥具有多靶點的作用機制。 (3)Annexin V、aldolase A的免疫印跡驗證結(jié)果與蛋白質(zhì)分析結(jié)果相一致，證明了蛋白質(zhì)組學(xué)技