青蒿琥酯干預(yù)下Foxp3在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是自身免疫性疾病的一種，其以全身關(guān)節(jié)炎癥、破壞為主要臨床表現(xiàn)，本病以慢性、對稱性、破壞性多關(guān)節(jié)炎為主要特征，其中主要受累靶關(guān)節(jié)為近端指間關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)和腕關(guān)節(jié)，其他如顳關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)也常常累及。部分患者還可出現(xiàn)發(fā)熱、貧血、皮下結(jié)節(jié)等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)。RA的基本病理特點(diǎn)主要是關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，關(guān)節(jié)滑膜經(jīng)過以下幾個(gè)發(fā)展階段:滑膜充血、水腫、增生，最終逐漸形成血管翳，滑膜組

2、織因而增厚并且過度滲出包含多種細(xì)胞因子的滲液，滲出的細(xì)胞因子可侵犯關(guān)節(jié)軟骨，引起骨質(zhì)的破壞，對關(guān)節(jié)周圍的組織也可侵及，包括腱鞘、肌肉等，其破壞與腫瘤的損害過程相似，破壞過程的主要步驟是新的血管的形成與細(xì)胞外基質(zhì)的降解。治療的關(guān)鍵在于減緩骨侵蝕的速度，通過控制細(xì)胞炎性因子的釋放和減慢血管翳的形成。目前臨床上常使用改變病情藥(disease modifying anti-rheumatic drug，DMARDs)聯(lián)合生物制劑治療RA以預(yù)防

3、、延緩骨質(zhì)破壞。但生物制劑的治療成本高，廣泛應(yīng)用有局限性。近期有研究提示，青蒿琥酯可作為一種潛在的免疫抑制劑，具有低毒，高效的特點(diǎn)。其屬于青蒿素的一種半合成衍生物。并且研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯發(fā)揮作用的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)NF-κB的信號(hào)通路，抑制受LPS調(diào)控的滑膜細(xì)胞中TNF-α的分泌。從而抑制RA滑膜炎癥，同時(shí)還可通過抑制IL-17分泌及調(diào)節(jié)這兩種細(xì)胞因子的協(xié)同性而抑制滑膜炎癥反應(yīng)，從而減少骨侵蝕和骨破壞。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regu

4、latory T cells，Treg cells)是一群免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，可以調(diào)控T淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)，其關(guān)鍵的作用是在機(jī)體免疫過程中維持免疫耐受、防止自身免疫性疾病發(fā)生。Foxp3是一種轉(zhuǎn)錄因子，作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志，決定了CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的相關(guān)功能如發(fā)育、表達(dá)和維持免疫功能。
　　本研究通過建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的大鼠動(dòng)物模型，觀察不同劑量青蒿琥酯干預(yù)下Foxp3在大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中的表達(dá)，探討青蒿

5、琥酯對Foxp3相關(guān)信號(hào)通路活化的調(diào)控作用，研究青蒿琥酯是否通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3(forkhaed/winged helix transcription factor，翼狀螺旋/叉頭轉(zhuǎn)錄因子)而起作用下調(diào)IL-17的活性而起免疫調(diào)節(jié)作用，明確青蒿琥酯確切的治療靶位。
　　方法:建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)(collagen induced arthritis，CIA)的雄性Wistar大鼠模型，通過觀察指標(biāo)評估發(fā)病程度。取滑膜并將滑膜細(xì)

6、胞培養(yǎng)至5-7代，分為正常對照組、關(guān)節(jié)炎組隨機(jī)分為CIA模型對照組、不同濃度青蒿琥酯組、甲氨蝶呤(MTX)組、硫酸羥氯喹組、甲基潑尼松龍組干預(yù)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)檢測Foxp3在不同組大鼠CIA滑膜細(xì)胞中的基因表達(dá)，western blotting檢測Foxp3在不同組大鼠CIA滑膜細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.CIA大鼠造模成功率達(dá)93.3％(56/61)。
　　2.臨床評估指標(biāo):模型

7、組大鼠與正常大鼠比較，有以下表現(xiàn):體重減輕，活動(dòng)量減少，精神欠佳等;造模后關(guān)節(jié)炎癥狀進(jìn)行性加重，以對稱性后肢關(guān)節(jié)受累明顯;免疫后第6周關(guān)節(jié)炎癥狀達(dá)高峰，后逐漸進(jìn)入慢性期，出現(xiàn)關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形。
　　3.踝關(guān)節(jié)鉬靶拍片:CIA大鼠第10周影像學(xué)改變:骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、骨破壞、關(guān)節(jié)間隙狹窄;CIA大鼠第21周影像學(xué)改變:明顯的骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、嚴(yán)重骨破壞、關(guān)節(jié)損毀，部分呈半脫位。
　　4.基因表達(dá):各藥物干預(yù)組成纖維樣

8、滑膜細(xì)胞較CIA模型組減少，F(xiàn)oxp3表達(dá)增加，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。20ng/ml青蒿琥酯組Foxp3表達(dá)高于5ng/ml青蒿琥酯、10ng/ml青蒿琥酯、MTX組、硫酸羥氯喹組及甲基潑尼松龍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.蛋白表達(dá):各藥物干預(yù)組增生的滑膜細(xì)胞較CIA模型組減少，F(xiàn)oxp3較CIA模型組表達(dá)增加，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。20ng/ml青蒿琥酯組Foxp3表達(dá)高于5

9、ng/ml青蒿琥酯、10ng/ml青蒿琥酯、MTX組、硫酸羥氯喹組及甲基潑尼松龍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.在CIA大鼠模型中:關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)≥6分;關(guān)節(jié)腫脹度、骨質(zhì)疏松、骨破壞等表現(xiàn)均較正常組嚴(yán)重。
　　2.青蒿琥酯可上調(diào)T淋巴細(xì)胞Foxp3的表達(dá)，在其干預(yù)下Foxp3在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜細(xì)胞中的表達(dá)隨著劑量的加大而明顯增加，與劑量呈正相關(guān)。20ng/ml青蒿琥酯組Foxp3