頰針干預卵蛋白誘導類風濕關(guān)節(jié)炎模型家兔的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、目的：本研究以卵蛋白為誘導劑建立RA家兔動物模型，經(jīng)頰針干預后，應用蛋白質(zhì)組學定量和生物信息學技術(shù)分析腦脊液中蛋白質(zhì)表達水平，從蛋白質(zhì)組學水平和細胞信號通路探討頰針在RA中鎮(zhèn)痛的分子機制，為促進頰針治療RA的臨床廣泛應用提供理論依據(jù)。
　　方法：經(jīng)痛閾篩選健康大耳白家兔40只，隨機挑選10只為對照組，其余家兔以卵蛋白誘導建立類風濕性關(guān)節(jié)炎家兔模型后，隨機均分為3組，即模型組、頰針組和體針組；對頰針組和體針組分別施以頰針和體針干預后

2、，采集腦脊液和雙后肢膝關(guān)節(jié)滑膜；經(jīng)行為學觀察、痛閾測定、關(guān)節(jié)滑膜病理組織學檢測、腦脊液蛋白質(zhì)組學定量技術(shù)分析驗證、生物信息學技術(shù)分析及類風濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)差異蛋白的Western blotting驗證，觀察卵蛋白誘導RA家兔模型動物的行為學變化、痛閾變化和關(guān)節(jié)滑膜的組織病理學改變，建立腦脊液蛋白質(zhì)表達譜和篩選差異蛋白，解析差異蛋白質(zhì)參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。
　　結(jié)果：通過以上研究，結(jié)果表明：
　　1.針刺干預后效應

3、差異分析：經(jīng)頰針和體針干預后，與模型組相比，家兔精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，飲食量增加，體重緩慢增加，膝關(guān)節(jié)腫脹緩解，關(guān)節(jié)活動增強，痛閾逐漸恢復，痛閾差異顯著（P＜0.05），頰針組與體針組痛閾相比，頰針即時鎮(zhèn)痛效應優(yōu)于體針（P＜0.05）；影像學顯示膝關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹緩解，關(guān)節(jié)間隙狹窄程度和骨質(zhì)破壞程度有所改善；病理組織學觀察，滑膜組織新生血管減少，炎癥細胞數(shù)量明顯減少，滑膜變薄。
　　2.腦脊液中差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定：應用 iTRAQ技

4、術(shù)分析鑒定類風濕關(guān)節(jié)炎各組家兔腦脊液差異表達蛋白，模型組與正常組家兔腦脊液共篩選出153個差異表達蛋白，其中表達上調(diào)78個，下調(diào)75個；頰針組與模型組家兔腦脊液共篩選出差異表達蛋白734個，其中表達上調(diào)329個，下調(diào)405個；體針組與模型組家兔腦脊液共篩選出差異表達蛋白152個，其中表達上調(diào)98個，下調(diào)54個；頰針組與體針組家兔腦脊液共篩選出差異表達蛋白695個，其中表達上調(diào)283個，下調(diào)412個。
　　3.生物信息學分析：

5、>　　3.1 差異蛋白GO分析：從生物過程、細胞成分、分子功能方面對差異蛋白分析表明，模型組與正常組家兔腦脊液差異蛋白生物過程分為272類，細胞成分分為90類，分子功能分為158類；頰針與模型組家兔差異蛋白生物過程分為1197類，細胞位置分為259類，分子功能分為535類；體針與模型組家兔腦脊液差異蛋白生物過程分為269類，細胞成分分為83類，分子功能分為160類；頰針組與體針組家兔腦脊液差異蛋白生物過程分為332類，細胞成分分為112

6、類，分子功能分為190類。這些差異蛋白質(zhì)與RA相關(guān)的生物過程主要涉及物質(zhì)轉(zhuǎn)運、能量代謝過程，細胞成分主要涉及細胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等，分子功能主要涉及有能量代謝、抗原結(jié)合、肌動蛋白結(jié)合、炎癥反應、趨化因子等。
　　由以上分析可知，差異蛋白質(zhì)涉及種類較多，除了少數(shù)功能相對獨立的蛋白質(zhì)外，大多數(shù)蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮有協(xié)同作用或其他作用，與類風濕關(guān)節(jié)炎病變的復雜性相吻合，提示類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展是一個多蛋白參與的復雜過程。
　　3

7、.2 差異蛋白KEGG分析：各組家兔腦脊液差異表達蛋白質(zhì)相關(guān)經(jīng)典通路分析表明，模型組與正常組家兔腦脊液的差異蛋白參與了65條經(jīng)典通路，頰針組與模型組家兔腦脊液的差異蛋白參與了199條經(jīng)典通路，體針組與模型組家兔腦脊液的差異蛋白參與了79條經(jīng)典通路，頰針組與體針組家兔腦脊液的差異蛋白參與了193條經(jīng)典通路。這些經(jīng)典通路與RA相關(guān)的主要有AMPK信號通路、細胞因子受體通路、Jak-STAT信號通路、趨化因子信號通路等。
　　由此可知，

8、差異蛋白質(zhì)中涉及RA的信號通路較多，提示RA的發(fā)病是多條信號轉(zhuǎn)導通路參與的復雜過程所致，頰針通過調(diào)節(jié)家兔腦脊液差異蛋白多條信號轉(zhuǎn)導通路的改變發(fā)揮其鎮(zhèn)痛效應，提示頰針具有多靶點治療的作用機制。
　　4.差異蛋白驗證結(jié)果：通過生物信息學分析找出不同組間與類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的部分差異蛋白CD14、TNF-α和CCL3，應用Western blotting進行驗證分析。結(jié)果表明，與空白組相比，模型組中三者表達量均上調(diào)，差異具有統(tǒng)計意義（P

9、＜0.05），而在頰針與體針組中，三者表達水平下降，體針組下調(diào)較明顯。這一結(jié)果與蛋白組學分析結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.頰針療法能改善RA模型家兔的一般行為學表現(xiàn)、影像學表現(xiàn)、病理形態(tài)表現(xiàn)和痛閾，頰針的即時鎮(zhèn)痛效應優(yōu)于體針（P＜0.05）；
　　2.通過蛋白質(zhì)組學定量技術(shù)與生物信息學分析，提示RA的發(fā)病機制可能是多個異常蛋白的表達及多條信號轉(zhuǎn)導通路改變引起。
　　3.頰針療法通過調(diào)節(jié)家兔腦脊液中糖酵解途徑、磷