豬繁殖與呼吸綜合征病毒多基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及免疫學(xué)研究.pdf

1、本研究試圖應(yīng)用分子生物學(xué)試驗方法構(gòu)建表達(dá)豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3、ORF5、ORF6基因的真核重組質(zhì)粒，并進(jìn)行小鼠的免疫試驗，以探討所構(gòu)建核酸疫苗的免疫保護作用。試驗由3部分構(gòu)成： 1.采用RT-PCR方法克隆得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF3、ORF5的基因序列，將ORF3和ORF5基因在克隆載體pMD18-T上串聯(lián)后，將其定向插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4.0多克隆位點，瓊脂糖電泳和測序表明成功構(gòu)建包含豬繁殖與呼吸綜合征

2、病毒ORF3、ORF5基因的重組質(zhì)粒pcDNA4.0-ORF3.ORF5。 2.將ORF6和ORF3-ORF5基因串聯(lián)后，定向克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4.0上，構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5。序列測定證明，重組質(zhì)粒pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5包含完整的ORF6、ORF3和ORF5基因，從而為其免疫試驗的研究奠定了基礎(chǔ)。 3.重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDN.A4.0-O

3、RF3-ORF5、pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取和純化后，小鼠后肢脛前肌注射100μg只(50μg/腿)，共2次，間隔2周。每隔7 d采血1次，檢測ELISA抗體效價和血清中和抗體水平。并分不同時間段采集組織樣品，通過PCR檢測peDNA4.0-ORF6-ORF3.ORF5質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)的動態(tài)分布情況。結(jié)果顯示，血清抗體水平首免后逐漸增高，2免后14～21d逐漸達(dá)到高峰，且重組質(zhì)粒組產(chǎn)生的抗體水平明顯高于空載