組蛋白H3K9二甲基化參與斑馬魚神經(jīng)丘發(fā)育和毛細(xì)胞再生.pdf

1、噪聲、耳毒性藥物和衰老等因素導(dǎo)致人類內(nèi)耳機(jī)械能感受細(xì)胞毛細(xì)胞的損傷和缺失，是導(dǎo)致獲得性感音神經(jīng)性耳聾的主要原因。和低等的脊椎動物如魚類、禽類不同，哺乳類動物毛細(xì)胞損傷缺失后不能夠自發(fā)性再生，將導(dǎo)致不可逆的聽力損失。因此毛細(xì)胞再生調(diào)控成為了治療感音神經(jīng)性耳聾的終極靶標(biāo)。但是由于內(nèi)耳毛細(xì)胞深埋于頭顱顳骨中，標(biāo)本獲取和處理困難較大，并且不易直接觀察，為毛細(xì)胞發(fā)育和再生調(diào)控研究帶來了困難。
　　側(cè)線是位于魚類體表感知水流和壓力變化的機(jī)械感

2、受器，它是由一組相對獨(dú)立的神經(jīng)丘組成，位于神經(jīng)丘中央的機(jī)械感受器毛細(xì)胞以及位于周邊的非感覺支持細(xì)胞構(gòu)成神經(jīng)丘的基本結(jié)構(gòu)。側(cè)線毛細(xì)胞如內(nèi)耳毛細(xì)胞一樣來自始基，具有相似的發(fā)育和分化立體模式、相似的的結(jié)構(gòu)以及功能調(diào)控機(jī)制，由于斑馬魚側(cè)線器位于體表，便于活體觀察毛細(xì)胞，成為了研究毛細(xì)胞再生的經(jīng)典模型。但在不同的發(fā)育時期毛細(xì)胞再生可能受到側(cè)線器毛細(xì)胞發(fā)育及自我修復(fù)的影響，因此研究不同發(fā)育時期毛細(xì)胞再生能力及規(guī)律非常重要。
　　機(jī)械感受器的發(fā)

3、生（如內(nèi)耳器官發(fā)生、神經(jīng)丘發(fā)育）涉及到細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和分化過程，需要嚴(yán)格的時間和空間調(diào)控以產(chǎn)生相互作用的特定數(shù)目、分布和分化狀態(tài)的細(xì)胞。在此過程中特定基因的有序表達(dá)和功能調(diào)控具有重要的意義，因此以可遺傳的基因表達(dá)調(diào)控信息傳遞為主要研究內(nèi)容的表觀遺傳學(xué)成為了器官發(fā)生研究的熱點(diǎn)問題。
　　“組蛋白密碼”是其重要部分，核小體組蛋白上的共價修飾，在真核細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑和基因表達(dá)調(diào)控方面起重要作用。組蛋白甲基化作為一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素，

4、被認(rèn)為在基因表達(dá)的抑制或者活化、以及染色體結(jié)構(gòu)域中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　研究表明，在細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白甲基化和去甲基化過程處于動態(tài)平衡，兩過程分別由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶催化。常染色質(zhì)組蛋白單-，雙-甲基化主要由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTase)催化，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a主要作用于H3K9的單-、雙-甲基化。
　　有研究顯示G9a調(diào)控的H3K9甲基化是細(xì)胞分化的必要條件。G9a缺陷小鼠胚胎及其胚胎干細(xì)胞中甲基化H3

5、K9急劇下降，其研究結(jié)果表明G9a調(diào)節(jié)常染色體H3 K9的甲基化，其為早期胚胎發(fā)育所必需且參與發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄抑制。在小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞早期分化中，H3K9me2的可以檢測到，但出生后消失，提示H3K9me2參與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育。H3K9me2在內(nèi)耳發(fā)育及毛細(xì)胞再生過程中是否發(fā)揮生理作用目前尚不清楚，我們以斑馬魚側(cè)線器為模型，研究H3K9me2與毛細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育及再生的關(guān)系。
　　第一部分斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷?/p>

6、建立
　　目的：
　　建立研究斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，定量研究神?jīng)丘發(fā)育過程中細(xì)胞增殖及毛細(xì)胞分化過程，為神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　材料和方法：
　　選擇野生型AB品系斑馬魚，在3dpf-7dpf的發(fā)育過程中以活細(xì)胞染料FM1-43FX以及MyosinⅥ標(biāo)記毛細(xì)胞，BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞，觀察神經(jīng)丘的增殖及毛細(xì)胞的分化過程。合成地高辛標(biāo)記fgfr1，atoh1a的反義RNA探針，進(jìn)行斑馬

7、魚全標(biāo)本包埋的RNA原位雜交，研究fgfr1和atoh1a mRNA在神經(jīng)丘發(fā)育過程中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.3dpf～7dpf斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育分化的關(guān)鍵時期:以FM1-43FX標(biāo)記的毛細(xì)胞在幼魚孵育出來前已出現(xiàn)，隨著時間推移，毛細(xì)胞數(shù)目逐漸增加。3dpf為4.100±0.2049(n=6),4dpf為5.386±0.1809(n=14),5dpf為8.467±0.3528(n=6)，7dpf為9.225±0

8、.4061(n=8)。Student's t-test統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果:3dpf vs4dpf，P值=0.0006;4dpf vs5dpf，P值＜0.0001，差異具有顯著性。5dpf vs7dpf，P值=0.2017，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.3dpf～7dpf斑馬魚神經(jīng)丘B(yǎng)rdU陽性細(xì)胞繼續(xù)增加:BrdU陽性標(biāo)記見于神經(jīng)丘周邊區(qū)支持細(xì)胞細(xì)胞核，毛細(xì)胞細(xì)胞核陽性標(biāo)記少見。5dpf神經(jīng)丘B(yǎng)rdU陽性細(xì)胞數(shù)目2.300±0.3222

9、(n=6)，7dpf神經(jīng)丘B(yǎng)rdU陽性細(xì)胞4.333±0.4244(n=6)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示P=0.0003，二者差異有顯著性。
　　3.fgfr1、atoh1a在神經(jīng)丘發(fā)育過程中的表達(dá):FGFR mRNA在神經(jīng)丘的發(fā)育
　　過程中表達(dá)，證實(shí)FGF信號通路參與神經(jīng)丘的發(fā)育;側(cè)線器毛細(xì)胞前體細(xì)胞在分化為毛細(xì)胞時表達(dá)atoh1a，我們的研究顯示5dpf斑馬魚神經(jīng)丘中atoh1amRNA表達(dá)于神經(jīng)丘中央?yún)^(qū)，7dpf時atoh1

10、a表達(dá)降至低水平。由于神經(jīng)丘毛細(xì)胞此后繼續(xù)再生，atoh1a陽性毛細(xì)胞前體細(xì)胞仍將繼續(xù)存在，進(jìn)一步證實(shí)了atoh1a參與毛細(xì)胞分化及再生的過程。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立了研究斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞發(fā)育實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?
　　2.建立斑馬魚全標(biāo)本包埋的RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)方法;
　　3.定量研究了發(fā)育過程中神經(jīng)丘前體細(xì)胞增殖和毛細(xì)胞分化，為后期實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　第二部分斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞再生實(shí)驗(yàn)研究
　　

11、目的：
　　定量研究在不同發(fā)育階段神經(jīng)丘毛細(xì)胞再生能力，觀察最佳的研究神經(jīng)丘毛細(xì)胞再生的時間窗，建立斑馬魚神經(jīng)丘毛細(xì)胞再生實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　材料和方法：
　　選擇野生型AB品系斑馬魚，以活細(xì)胞染料FM1-43FX以及MyosinⅥ標(biāo)記毛細(xì)胞，BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞。新霉素處理3dpf，5dpf，7dpf斑馬魚，觀察損傷后即刻、24小時、48小時、72小時毛細(xì)胞損傷及恢復(fù)情況;合成地高辛標(biāo)記c-mycb，odc1的反義RNA

12、探針，進(jìn)行斑馬魚全標(biāo)本包埋的RNA原位雜交，研究c-mycb，odc1 mRNA在新霉素處理1小時后神經(jīng)丘中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞凋亡是新霉素介導(dǎo)的神經(jīng)丘毛細(xì)胞死亡的主要方式:以FM1-43FX活體染料（紅色）標(biāo)記毛細(xì)胞后，予新霉素處理1小時后固定觀察——位于神經(jīng)丘中央?yún)^(qū)向心性聚集的毛細(xì)胞消失，神經(jīng)丘外周區(qū)域可見多個散在的紅色質(zhì)膜包繞的圓形固縮小核——凋亡小體，提示細(xì)胞凋亡是新霉素介導(dǎo)的神經(jīng)丘毛細(xì)胞死亡的主要

13、方式。
　　2.不同發(fā)育階段神經(jīng)丘新霉素?fù)p傷后毛細(xì)胞再生的規(guī)律:3dpf斑馬魚新霉素?fù)p傷后24小時毛細(xì)胞數(shù)目4.250±0.1794(n=12)，5dpf斑馬魚新霉素?fù)p傷后24小時毛細(xì)胞數(shù)目2.507±0.1433(n=15)，7dpf斑馬魚新霉素?fù)p傷后24小時毛細(xì)胞數(shù)目1.333±0.1491(n=9);5dpf斑馬魚新霉素?fù)p傷后24小時，48小時，72小時毛細(xì)胞數(shù)目分別為2.507±0.1433(n=15)，3.900±0.2

14、878(n=8)，9.378±0.3307(n=9)，損傷后72小時毛細(xì)胞數(shù)目達(dá)正常對照組87.5％。
　　3.新霉素?fù)p傷后神經(jīng)丘細(xì)胞增殖狀態(tài):斑馬魚神經(jīng)丘在新霉素?fù)p傷后，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目增多，但多位于外周支持細(xì)胞，新生毛細(xì)胞中少見。損傷后72小時FM1-43FX與BrdU共標(biāo)細(xì)胞占毛細(xì)胞總數(shù)的24.94％±3.75％。
　　4.c-mycb和odc1 mRNA在新霉素?fù)p傷后神經(jīng)丘中的表達(dá):新霉素?fù)p傷后毛細(xì)胞再生機(jī)制啟動

15、，研究結(jié)果顯示c-mycb及其下游靶向odc-1在神經(jīng)丘表達(dá)，且二者分布類似。
　　結(jié)論：
　　1.系統(tǒng)研究了神經(jīng)丘發(fā)育不同階段毛細(xì)胞再生的規(guī)律，選擇5dpf斑馬魚進(jìn)行毛細(xì)胞再生研究，可剔除毛細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育的干擾，是研究毛細(xì)胞再生的最佳時間窗。
　　2.損傷后毛細(xì)胞的恢復(fù)多為直接轉(zhuǎn)分化而來，部分新生毛細(xì)胞源于細(xì)胞增殖再生。
　　3.c-mycb和odc1 mRNA在新霉素處理后神經(jīng)丘表達(dá)，提示兩者參與新霉素介導(dǎo)的毛

16、細(xì)胞損傷后的修復(fù)過程，以及抗凋亡保護(hù)作用。
　　第三部分 H3K9me2在正常神經(jīng)丘發(fā)育過程中的作用
　　目的：
　　定量研究斑馬魚神經(jīng)丘發(fā)育過程中H3K9me2的表達(dá)，探索H3K9me2在神經(jīng)丘發(fā)育過程中的作用。
　　材料和方法：
　　1.分別取3dpf，4dpf，5dpf，7dpf野生型斑馬魚作以下3標(biāo)免疫熒光染色:
　　(1) FM1-43FX標(biāo)記毛細(xì)胞
　　(2) anti-H3K9me

17、2
　　(3) DAPI
　　2.新霉素?fù)p傷后恢復(fù)72hrs后，作以下3標(biāo)免疫熒光染色:
　　(1) FM1-43FX標(biāo)記毛細(xì)胞
　　(2) anti-H3K9me2
　　(3) DAPI
　　結(jié)果：
　　1.神經(jīng)丘發(fā)育成熟過程中H3K9me2表達(dá)水平逐漸降低:H3K9me2在3dpf表達(dá)于神經(jīng)丘大部分細(xì)胞的細(xì)胞核中，4dpf隨著神經(jīng)丘毛細(xì)胞分化增多，H3K9me2僅散在表達(dá)于神經(jīng)丘外圍細(xì)胞;毛

18、細(xì)胞分化過程中H3K9me2降低，毛細(xì)胞發(fā)育成熟后逐漸消失(7dpf)。不同發(fā)育階段的斑馬魚神經(jīng)丘中H3K9me2(+)細(xì)胞與FM1-43FX(+)細(xì)胞的比值3dpf:1.830±0.09815(n=4);4dpf:1.195±0.03175(n=4);5dpf:1.060±0.1097(n=4);7dpf:0.6250±0.04907(n=4)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:3dpf vs4dpf，P值=0.0008;4dpf vs5dpf，P

19、值=0.2819;5dpf vs7dpf，P值=0.0111。3dpf和4dpf，5dpf和7dpf比值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.新霉素?fù)p傷后神經(jīng)丘H3K9me2表達(dá)增加:新霉素?fù)p傷后72小時神經(jīng)丘毛細(xì)胞已基本恢復(fù)，花結(jié)形成，其外周亦可見較多H3K9me2陽性細(xì)胞。H3K9me2(+)細(xì)胞與FM1-43FX(+)細(xì)胞的比值1.153±0.07204(n=4)，與7dpf正常對照組0.6250±0.04907(n=4)相比，P值