二甲基精氨酸二甲胺水解酶2重組蛋白純化及功能研究.pdf

1、研究背景和目的：心血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。一氧化氮介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)降低是大多數(shù)心血管疾病的早期病理表現(xiàn)。大量研究表明，內(nèi)源性一氧化氮合酶(NOS)抑制物一非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能不全的重要物質(zhì)。二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)是內(nèi)源性ADMA的主要代謝酶。已知DDAH存在兩種亞型--DDAHl和DDAH2；前者主要分布于表達(dá)神經(jīng)型NOS的組織，后者則主要分布于表達(dá)內(nèi)皮型NOS的心血管

2、組織；因此，DDAH2是決定心血管系統(tǒng)ADMA含量的關(guān)鍵因素。但目前尚無直接增加DDAH2表達(dá)和活性的藥物。近年來發(fā)現(xiàn)一種來源于人類免疫缺陷病毒HIV-1 Trat(Trans-activatot transcription)蛋白的蛋白功能區(qū)，稱之為PTD區(qū)段(Protein transduction domain)，能有效地引導(dǎo)肽段或蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，具有蛋白傳送功能。因此，本課題將Tat PTD區(qū)段融合于人DDAH2蛋白的N端，使DD

3、AH2蛋白具備穿膜能力，定位于細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮作用。在此基礎(chǔ)上，用多種心血管的危險(xiǎn)因子如高糖、同型半胱氨酸、游離脂肪酸如棕櫚酸處理培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC-12)，觀察上述因素對細(xì)胞內(nèi)DDAH1和DDAH2表達(dá)及DDAH活性的影響：并進(jìn)一步探討外源性給予Tat-hDDAH2蛋白能否直接增加細(xì)胞中DDAH2蛋白含量，抵抗上述因素對DDAH活性的抑制，從而為大規(guī)模開發(fā)可應(yīng)用的重組蛋白產(chǎn)品奠定技術(shù)基礎(chǔ)，為心血管疾病防治拓開新途徑。另一

4、方面，用重組的DDAH2融合蛋白作為抗原，制備家兔來源的抗血清，用于DDAH2表達(dá)的檢測。 方法：①構(gòu)建重組pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2原核表達(dá)載體：以我室以前構(gòu)建pcDNA3.1-hDDAH2質(zhì)粒為模板，用Tat-hDDAH2上下游引物擴(kuò)增Tat-hDDA1-12基因，重組到T載體上，構(gòu)建pGEM-Tat-hDDAH2質(zhì)粒，然后再分別用Sal I和BamH I雙酶切pGEM-Tat-hDDAH2和原核表達(dá)載體pGE

5、X-6p-1，連接重組成pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2載體；再轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌BL21體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，并通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件提高目的基因的原核表達(dá)水平和可溶性融合蛋白的含量。②重組Tat-hDDAH蛋白的純化：將包涵體形式的重組蛋白溶于8 mol/L的尿素溶液中，然后經(jīng)過復(fù)性、透析得到復(fù)性蛋白GST-Tat-hDDAH；再將從細(xì)菌裂解液上清中的可溶性GST-Tat-hDDAH蛋白和從包涵體中得到的復(fù)性蛋白與還原型谷胱甘肽瓊脂糖珠(

6、Glutathione Sepharose 4B)充分混勻，經(jīng)過Glutathione Sepharose4B的親和吸附得到純化的GST-Tat-hDDAH2融合蛋白，最后經(jīng)過PreScission蛋白酶切，獲得重組的Tat-hDDAH2蛋白。③抗hDDAH2抗血清的制備：重組pGEX-6p-1-hDDAH2載體；一再轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到大量含GST-hDDAH2蛋白的包涵體；經(jīng)2％的脫氧膽酸鈉溶液洗滌后得到較純化的包涵

7、體，并將其作為抗原與佐劑充分乳化后經(jīng)皮下注射免疫新西蘭大白兔，制備抗DDAH2的多克隆抗體，并用ELISA、western blot檢測DDAH2抗體的滴度和特異性，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中DDAH2蛋白表達(dá)的檢測。④重組Tat-hDDAH2蛋白的功能實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC-12，分別用心血管疾病的危險(xiǎn)因子高糖、同型半胱氨酸、游離脂肪酸如棕櫚酸(palmitic acid，PA)孵育HUVEC-12 16～48h，檢測這些危險(xiǎn)因子

8、對內(nèi)皮細(xì)胞DDAH1和DDAH2蛋白表達(dá)和DDAH活性的影響；并觀察Tat-hDDAH2蛋白能否逆轉(zhuǎn)上述因素對DDAH活性的損害。 結(jié)果：①經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定，原核表達(dá)載體pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2和pGEX-6p-1-hDDAH2(Fig.4)構(gòu)建成功；并轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，通過篩選不同的誘導(dǎo)條件，發(fā)現(xiàn)用較低的IPTG濃度(0.05 mM)在低溫(250c)環(huán)境下和適當(dāng)?shù)匮娱L誘導(dǎo)時(shí)間(8h)有利于

9、可溶性融合蛋白GST-Tat-hDDAH2和GST-hDDAH2在細(xì)菌體內(nèi)的表達(dá)，但在原核細(xì)胞中仍以不溶性的包涵體為主：將包涵體變性、復(fù)性后，再經(jīng)純化和PreScission蛋白酶酶切，最后獲得重組的Tat-hDDAH2和hDDAH2蛋白。②將1升含有pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2質(zhì)粒和pGEX-6p-1-hDDAH2質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液于12000 rpm 40c離心10 min，去上清，將細(xì)菌用100 mlPBS重懸；經(jīng)超聲裂

10、解后于12000 rpm 40c離心10 min，分離上清中的可溶性融合蛋白與包涵體；將包涵體變性、復(fù)性后，分別將包涵體中復(fù)性的融合蛋白和上清中可溶性的融合蛋白經(jīng)Glutathione Sepharose 4B親和吸附，得到純化的GST-Tat-hDDAH2融合蛋白2.169 mg和純化的GST-hDDAH2融合蛋白2.571 mg；再分別將GST-Tat-hDDAH2和GST-hDDAH2融合蛋白經(jīng)PreScission蛋白酶酶切后，

11、可得到總量為1.362 mg的Tat-hDDAH2重組蛋白和1.469 mg的DDAH2重組蛋白。③用含GST-hDDAH2蛋白的包涵體免疫新西蘭兔，10 W后用烏拉坦(0.8 g/kg，i.v.)麻醉，經(jīng)頸動脈插管取血，3000 rpm 40c離心10 min分離血清，加入終濃度為0.02％的疊氮鈉，從而獲得特異性抗hDDAH2、效價(jià)達(dá)1:10000以上的多克隆抗體，分裝后于-80。C保存，用于本課題中重組DDAH2蛋白、重組Tat-

12、hDDAH2蛋白的檢測以及內(nèi)皮細(xì)胞中的DDAH2蛋白表達(dá)測定。④分別用0.1～1μM的Tat-hDDAH2蛋白孵育內(nèi)皮細(xì)胞60 min，檢測內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2的表達(dá)及DDAH活性，以了解Tat-hDDAH2蛋白作用的量.效關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tat-hDDAH2蛋白呈劑量依賴性地上調(diào)DDAH2表達(dá)，增加DDAH活性；再分別用1μM的Tat-hDDAH2蛋白孵育內(nèi)皮細(xì)胞5～60 min，以觀測Tat-hDDAH2蛋白作用的時(shí).效關(guān)系，同樣發(fā)

13、現(xiàn)，Tat-hDDAH2蛋白呈時(shí)間依賴性地上調(diào)DDAH2表達(dá)，增加DDAH活性。此外，用10～30mM的葡萄糖孵育內(nèi)皮細(xì)胞48h，以及用1～3 mM的同型半胱氨酸和0.1～0.5 mM的棕櫚酸孵育內(nèi)皮細(xì)胞16h，均能呈劑量依賴性地抑制DDAH2表達(dá)，降低DDAH活性；用0.1～0.5μM的Tat-hDDAH2蛋白預(yù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞1h，能逆轉(zhuǎn)上述損傷因素對DDAH2表達(dá)和DDAH活性的抑制。 結(jié)論：①利用分子重組技術(shù)，成功地構(gòu)建了p

14、GEX-6p-1-Tat-hDDAH2和pGEX-6p-1-hDDAH2原核表達(dá)載體：②分別將pGEX-6p-1-Tat-hDDAH2和pGEX-6p-1-hDDAH2載體轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，經(jīng)純化后獲得了較高純度的Tat-hDDAH2和hDDAH2重組蛋白，實(shí)驗(yàn)證明，重組的Tat-hDDAH2具有強(qiáng)的穿膜能力，并呈劑量和時(shí)間依賴性地增加內(nèi)皮細(xì)胞中DDAH2的蛋白含量，上調(diào)DDAH活性，具有良好的功能；③利用重組的GST-hDDAH2