二甲基精氨酸-二甲胺水解酶對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老的調(diào)控與糖尿病血管功能障礙.pdf

1、第一章、二甲基精氨酸-二甲胺水解酶對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化及功能的調(diào)控作用
　　 背景：
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞是一類能分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞,促進(jìn)血管新生和改善心功能的干細(xì)胞。EPCs參與血管修復(fù)和血管新生,為治療缺血性疾病提供了新的策略。
　　 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是調(diào)節(jié)EPCs功能最強(qiáng)的因子。VEGF與2型VEGF受體(KDR)相互作用而調(diào)節(jié)EPCs功能,包括內(nèi)皮修復(fù)與血管新生。
　　 二甲基精氨酸-二甲胺水

2、解酶能特異性的水解L-精氨酸的同類物非對(duì)稱二甲基精氨酸。ADMA是一種主要的內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物,能競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS,減少一氧化氮合成。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)皮細(xì)胞衰老和血管新生涉及DDAH/ADMA途徑。
　　 人類沉默信息調(diào)節(jié)因子2(Silent information regulator2,Sir2)SIRT1是Ⅲ型組蛋白去乙?；鞍?能引起基因表達(dá)沉默。研究發(fā)現(xiàn),SIRT1通過(guò)DDAH/ADMA途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞衰老。文獻(xiàn)報(bào)道,

3、高糖誘導(dǎo)EPCs衰老涉及SIT1途徑。
　　 基于DDAIMADMA與SIRT1參與血管新生及細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)以及SIRT1介導(dǎo)DDAH/ADMA途徑的效應(yīng),我們推測(cè)DDAH/ADMA可能通過(guò)VEGF/KDR途徑參與EPCs分化與功能的調(diào)控,該作用可能涉及SIRT1途徑。因此,本實(shí)驗(yàn)在體外培養(yǎng)人外周血來(lái)源EPCs研究了DDAH/ADMA對(duì)EPCs功能與衰老的影響。
　　 方法：
　　 EPCs培養(yǎng)與鑒定:梯度離心加

4、選擇性粘附分離健康人外周血EPCs,用內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基EBM-2培養(yǎng)EPCs。培養(yǎng)7天后鑒定,包括乙?；兔芏戎鞍着c荊豆凝集素1雙染鑒定分化EPCs;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞CD133、CD34、CD45、KDR、vWF等標(biāo)記物表達(dá)。
　　 DDAH對(duì)EPCs分化及功能調(diào)控及機(jī)制:提取分化第7天的EPCs,檢測(cè)DDAH1和DDAH2表達(dá);提取第7和17天EPCs,檢測(cè)JDDAH2、SIRT1表達(dá)。為了探討DDAH2對(duì)EPCs功能的調(diào)控

5、,運(yùn)用pGCSIL-GFP-hDDAH2慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs沉默DDAH2表達(dá);為了探討SIRT1對(duì)DDAH2表達(dá)的調(diào)控,運(yùn)用pGCSIL-GFP-hSIRT1慢病毒轉(zhuǎn)染EPCs沉默SIRT1表達(dá)。提取細(xì)胞mRNA,Real-time PCR檢測(cè)DDAH1、DDAH2、SIRT1、VEGF和KDR mRNA表達(dá);流式細(xì)胞儀和WesternBlot檢測(cè)DDAH2和SIRT1蛋白表達(dá);高效液相色譜法(highperformance liqui

6、d chromatography,HPLC)檢測(cè)細(xì)胞上清ADMA;β-半乳糖苷酶活性評(píng)價(jià)EPCs衰老程度:tubedx管形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)EPCs血管形成能力;纖維連接蛋白檢測(cè)EPCs粘附能力。
　　 結(jié)果：
　　 人外周血EPCs主要以DDAH2亞型表達(dá)為主,且隨著EPCs分化時(shí)間延長(zhǎng)而增加。
　　 結(jié)論：
　　 DDAH2參與EPCs分化過(guò)程,并通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF/KDR途徑抑制EPCs的衰老,其作用機(jī)制涉及

7、SIRT1途徑。
　　 第二章、二甲基精氨酸一二甲胺水解酶/非對(duì)稱二甲基精氨酸在2型糖尿病內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老中的作用及機(jī)制
　　 研究背景
　　 血管病變是糖尿病主要并發(fā)癥之一。臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病時(shí),EPCs衰老率顯著增加、功能受損。高糖能誘導(dǎo)EPCs衰老、血管形成能力減弱,導(dǎo)致糖尿病血管功能減弱、側(cè)枝循環(huán)建立減少,引發(fā)心血管疾病。
　　 ADMA是一種新的心血管疾病預(yù)測(cè)因子,是內(nèi)源性NOS抑制物,能競(jìng)

8、爭(zhēng)性抑制NOS,減少NO的合成。糖尿病時(shí),細(xì)胞DDAH2表達(dá)降低、活性減弱,引起ADMA濃度增加并抑制NO生成。臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,糖尿病時(shí)EPCs功能受損與NO濃度降低有關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明,ADMA能直接損傷EPCs功能。
　　 糖尿病或高糖孵育EPCs時(shí),EPCs SIRT1表達(dá)下調(diào),同時(shí)伴隨細(xì)胞衰老和血管形成功能減退。內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SIRT1可上調(diào)DDAH2表達(dá),增加活性,促進(jìn)ADMA水解,抑制內(nèi)皮細(xì)胞自然衰老過(guò)程。

9、r>　　 本實(shí)驗(yàn)在2型糖尿病患者與培養(yǎng)EPCs細(xì)胞探討了EPCs衰老與DDAH/ADMA之間的關(guān)系,以及該過(guò)程是否涉及SIRT1途徑。
　　 方法：
　　 臨床研究:對(duì)照組與2型糖尿病患者組各40例。取外周靜脈血,分離血漿與細(xì)胞。HPLC檢測(cè)血漿ADMA濃度;梯度離心加粘附分離細(xì)胞EPCs,β-半乳糖苷酶活性評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老,Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞DDAH2、SIRT1 mRNA表達(dá)。
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

10、:外源性給予葡萄糖(10,20,30 mmol/L)孵育EPCs建立高糖損傷EPCs細(xì)胞模型,以甘露醇(10,20,30 mmol/L)作為滲透壓對(duì)照組,探討高糖誘導(dǎo)EPCs衰老;構(gòu)建pGC-FU-hDDAH2慢病毒探討DDAH2抑制高糖誘導(dǎo)EPCs衰老;外源性給予ADMA(0,0.3,0.6,1μtmol/L)探討ADMA誘導(dǎo)EPCs衰老作用;運(yùn)用SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇探討SIRT1調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)細(xì)胞衰老作用機(jī)制。
　　 梯度

11、離心加粘附分離正常人外周血EPCs。細(xì)胞處理48 h后,β-半乳糖苷酶活性評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老。其他指標(biāo)的檢測(cè)為細(xì)胞處理24 h時(shí),Real-time PCR與Western Blot檢測(cè)DDAH2、SIRT1 mRNA與蛋白表達(dá),HPLC檢測(cè)細(xì)胞上清ADMA水平,Griess法檢測(cè)上清NO水平。
　　 結(jié)果：
　　 2型糖尿病患者外周血EPCs衰老率顯著升高,DDAH2與SIRT1mRNA表達(dá)下調(diào),同時(shí)伴隨ADMA水平升高。<

12、br>　　 結(jié)論：
　　 DDAH2/ADMA參與了高糖誘導(dǎo)的EPCs衰老,其作用涉及SIRT1途徑。
　　 第三章、白藜蘆醇衍生物改善2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老
　　 背景：
　　 白藜蘆醇(resveratrol,RSV)是一種多酚類的SIRT1天然激動(dòng)劑。SIRT1參與糖代謝和胰島素分泌的調(diào)節(jié)。糖尿病大鼠實(shí)驗(yàn)證明,RSV能上調(diào)VEGF與eNOS表達(dá),抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),提高糖尿病大

13、鼠骨髓細(xì)胞血管形成能力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明,RSV促進(jìn)人外周血EPCs增殖、遷移以及血管新生。此外,RSV也能抑制TNF-α所致EPCs損傷。
　　 (E)-3,5,4'-三甲氧基-1,2-二苯乙烯((E)-3,5,4'-trimethoxystilbene,BTM-0512)是RSV的甲基化衍生物,其口服吸收率與半衰期均優(yōu)于RSV。
　　 依據(jù)RSV對(duì)血管內(nèi)皮和EPC保護(hù)作用以及SIRT1-DDAH2/ADMA對(duì)EPCs功能

14、及衰老的調(diào)節(jié)作用,本實(shí)驗(yàn)在高脂飲食加單次腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘發(fā)的2型糖尿病大鼠模型與培養(yǎng)大鼠骨髓EPCs細(xì)胞,探討RSV衍生物BTM-0512能否改善胰島素抵抗,以及對(duì)EPCs衰老的影響及機(jī)制。
　　 方法：
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn):高脂飲食加單次腹腔注射STZ(35 mg/kg)建立2型糖尿病大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組、BTM-0512低劑量組(10 mg/kg)和BTM-05

15、12高劑量組(40 mg/kg)。大鼠連續(xù)灌胃3周。
　　 取大鼠全血,分離血漿檢測(cè)大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血紅蛋白(Hb1AC)、葡萄糖耐量(OGTT)、HOME.IR、胰島素敏感指數(shù)(IAI)、胰島素分泌指數(shù)(IS)以及ADMA濃度。切取胸主動(dòng)脈觀測(cè)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng),免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮DDAH2、SIRT1蛋白表達(dá)。采用梯度離心加選擇性粘附分離大鼠骨髓EPCs細(xì)胞,β-半乳糖苷酶活性評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老程度,Real-tim

16、e PCR檢測(cè)EPCs DDAH2、SIRT1mRNA表達(dá),tube小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs血管形成能力,transwell小室評(píng)價(jià)EPCs遷移能力,纖維連接蛋白粘附法評(píng)價(jià)EPCs粘附能力。
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn):高糖處理EPCs,探討B(tài)TM-0512(0.3,1,3μM)抑制高糖誘導(dǎo)EPCs衰老及可能機(jī)制,給予SIRT1特異性阻斷劑splitomicin(50μM)探討SIRT1在BTM-0512對(duì)EPCs保護(hù)中作用。Β-半乳糖苷酶

17、活性評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老,Real-time PCR檢測(cè)DDAH2、SIRT1 mRNA表達(dá),Western Blot檢測(cè)DDAH2蛋白表達(dá);HPLC檢測(cè)細(xì)胞上清ADMA水平。
　　 結(jié)果：
　　 BTM-0512能劑量依賴性降低2型糖尿病大鼠FBG和Hb1AC,改善HOME.IR和IAI,但對(duì)OGTT與IS沒(méi)有影響。
　　 在培養(yǎng)EPCs,BTM-0512能劑量依賴性抑制高糖誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,上調(diào)細(xì)胞DDAH2、SIRT1