非對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(ADMA)對(duì)糖尿病紅細(xì)胞變形能力及胰島素抵抗的影響.pdf

1、第一章 研究背景 紅細(xì)胞變形能力下降可引起微循環(huán)灌注障礙，參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。研究表明，信號(hào)分子一氧化氮（NO）參與紅細(xì)胞變形能力的調(diào)節(jié)。不對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸（ADMA）是機(jī)體內(nèi)NO合成的內(nèi)源性調(diào)節(jié)物質(zhì)，可通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO生成而引起內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙。最近的研究顯示，高血壓病人紅細(xì)胞膜流動(dòng)性與血漿ADMA升高呈負(fù)相關(guān)，但ADMA對(duì)紅細(xì)胞變形能力的確切影響及作用機(jī)制未明?；谔悄虿r(shí)紅細(xì)胞變形能力下

2、降以及血漿ADMA含量增加，本實(shí)驗(yàn)擬在STZ誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型及離體實(shí)驗(yàn)，探討糖尿病紅細(xì)胞變形能力降低是否與ADMA有關(guān)；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討ADMA的作用機(jī)制。 研究方法 （1）SD大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素STZ（65mg/kg）誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性糖尿病，檢測(cè)不同病程（2，4，8周）NO（硝酸還原酶法）、ADMA（HPLC）及紅細(xì)胞變形能力（激光衍射法）的變化； （2）取離體的糖尿病大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)，與健康SD大

3、鼠的紅細(xì)胞共孵育，觀察紅細(xì)胞變形能力的變化；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察左旋精氨酸（L-arginine，L-arg）預(yù)處理能否改善糖尿病大鼠動(dòng)脈環(huán)孵育對(duì)紅細(xì)胞變形能力的影響； （3）外源性應(yīng)用ADMA孵育紅細(xì)胞，檢測(cè)ADMA對(duì)紅細(xì)胞變形能力、NO、ROS（DCFH-DA熒光法）、MDA水平（比色法）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察左旋精氨酸（L-arg）或維生素E（vitaminE）能否對(duì)抗ADMA的作用。 研究結(jié)果 （1）

4、糖尿病大鼠成模4周后，紅細(xì)胞變形能力開(kāi)始降低。血漿與紅細(xì)胞中ADMA以及紅細(xì)胞中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平則隨著病程延長(zhǎng)而逐漸增加。血漿中NO無(wú)明顯變化，但成模8周后紅細(xì)胞中NO含量降低。 （2）與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)與紅細(xì)胞共孵育30分鐘后明顯降低紅細(xì)胞變形能力。左旋精氨酸（10-5M）預(yù)處理可改善糖尿病大鼠血管環(huán)孵育后紅細(xì)胞變形能力的下降，而單用左旋精氨酸處理則與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。 （3）ADMA孵育紅

5、細(xì)胞后可時(shí)間與劑量依賴性降低紅細(xì)胞變形能力。ADMA（10-6M）處理30分鐘，紅細(xì)胞中NO生成降低，而MDA與ROS水平升高。左旋精氨酸預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)ADMA處理后紅細(xì)胞內(nèi)NO含量降低，而維生素E則可對(duì)抗ADMA所致的MDA與ROS生成增加。左旋精氨酸與維生素E紅細(xì)胞變形能皆可改善紅細(xì)胞變形能力。 結(jié)論 糖尿病紅細(xì)胞變形能力降低與ADMA水平升高有關(guān)，其機(jī)制可能涉及ADMA對(duì)血管及紅細(xì)胞源性NO生成，以及對(duì)紅細(xì)胞氧化應(yīng)激

6、的影響。 第二章 研究背景 胰島素抵抗是2型糖尿病、多囊卵巢綜合征等疾病的重要特征，可表現(xiàn)為肝臟、肌肉、脂肪組織等對(duì)胰島素敏感性下降而導(dǎo)致胰島素生物效應(yīng)低于正常。脂肪組織除了儲(chǔ)存脂肪與能量外，還具有強(qiáng)大的內(nèi)分泌功能，可分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)自身能量代謝與胰島素敏感性。研究表明，血漿ADMA與胰島素敏感性之間存在著潛在的關(guān)聯(lián)，而脂肪細(xì)胞內(nèi)亦存在與ADMA代謝有關(guān)的酶系，可合成與分泌ADMA。因此，本研究擬通過(guò)高脂加S

7、TZ誘導(dǎo)的胰島素抵抗糖尿病動(dòng)物模型及高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型，運(yùn)用二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）基因過(guò)表達(dá)技術(shù)，探討糖尿病時(shí)脂肪細(xì)胞DDAH/ADMA系統(tǒng)與胰島素抵抗之間的關(guān)聯(lián)。 研究方法 （1）在高脂飼養(yǎng)加小劑量STZ（35mg/kg）誘導(dǎo)的胰島素抵抗糖尿病大鼠模型，檢測(cè)脂肪組織中DDAH、ADMA的變化，分析其與胰島素敏感性之間的關(guān)聯(lián)。DDAH表達(dá)采用免疫組化及實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)，DDAH的活性以降解

8、ADMA的量間接評(píng)價(jià)。 （2）高糖處理體外培養(yǎng)小鼠來(lái)源的3T3-L1脂肪細(xì)胞，檢測(cè)高DDAH、ADMA以及胰島素受體底物-1（IRS-1）及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-4（GLUT4）mRNA表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，觀察人類(lèi)DDAH基因（hDDAH）過(guò)表達(dá)（瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hDDAH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）能否對(duì)抗高糖對(duì)IRS-1與GLUT4的影響。小鼠DDAH1、DDAH2、IRS-1與GLUT4的mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，hDDAH

9、的表達(dá)采用RT-PCR結(jié)合瓊脂糖電泳檢測(cè)。 研究結(jié)果 （1）SD大鼠經(jīng)高脂飼養(yǎng)加小劑量STZ誘導(dǎo)后，經(jīng)檢測(cè)血糖、血漿胰島素，進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)及計(jì)算HOMA胰島素抵抗指數(shù)，確證伴有胰島素抵抗的2型糖尿病模型成立。糖尿病大鼠血中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）及低密度脂蛋白（LDL）升高，而高密度脂蛋白（HDL）及體重降低。 （2）與對(duì)照組相比，糖尿病大鼠脂肪組織中DDAH2表達(dá)、DDAH與NOS活性、NO水平顯著

10、降低，而ADMA含量升高，伴隨著IRS-1、GLUT4mRNA表達(dá)下調(diào)。 （3）相關(guān)分析表明，脂肪組織中DDAH及NOS活性、NO含量與血糖、OGTT曲線下面積、HOMA抵抗指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，且與血漿胰島素水平正相關(guān)。ADMA則與血糖、OGTT曲線下面積及HOMA抵抗指數(shù)正相關(guān)。 （4）高糖處理72小時(shí)可下調(diào)脂肪細(xì)胞中DDAH2表達(dá)，而滲透壓對(duì)照組對(duì)DDAH表達(dá)無(wú)明顯影響。 （5）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hDDAH2基因后再予以高糖

11、處理72小時(shí)，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染組hDDAH2mRNA表達(dá)增加，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組中未檢測(cè)到hDDAH2mRNA表達(dá)。hDDAH基因過(guò)表達(dá)可增加脂肪細(xì)胞中DDAH活性，并且降低ADMA含量。 （6）高糖處理可下調(diào)脂肪細(xì)胞中IRS-1與GLUT4mRNA表達(dá)，而hDDAH基因過(guò)表達(dá)則可對(duì)抗高糖對(duì)IRS-1與GLUT4的抑制作用。 結(jié)論 糖尿病胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙可能與脂肪組織DDAH表達(dá)/活性降低及ADMA含量增加有關(guān)，ADM

12、A可能是誘導(dǎo)胰島素抵抗的新的脂肪細(xì)胞因子。 第三章ADMA誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗及機(jī)制研究 研究背景 既往的研究表明，ADMA與葡萄糖代謝及胰島素敏感性存在關(guān)聯(lián)，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)脂肪組織源性DDAH/ADMA系統(tǒng)參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。然而，DDAH/ADMA系統(tǒng)影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制目前并不清楚。 大量研究證實(shí)，在胰島素抵抗的發(fā)生過(guò)程中，氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)是重要的發(fā)病機(jī)制，且氧化應(yīng)激與炎癥之間存在

13、關(guān)聯(lián)。文獻(xiàn)報(bào)道，炎癥因子Toll樣受體4（TLR4）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)受活性氧自由基（ROS）調(diào)節(jié)。近年來(lái)研究顯示，內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物ADMA除降低NO生成外，還可誘導(dǎo)ROS及炎癥因子生成。因此，本研究擬通過(guò)外源性應(yīng)用ADMA以觀察ADMA能否誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，并進(jìn)一步探討其機(jī)制是否涉及氧化應(yīng)激/TLR4炎癥途徑。 研究方法 （1）3T3-L1前脂肪細(xì)胞促分化成熟后，以外源性ADMA處理，檢測(cè)無(wú)胰島素刺激的基礎(chǔ)狀

14、態(tài)及胰島素誘導(dǎo)狀態(tài)下2-脫氧-D-[3H]葡萄糖（2-DG）的攝取率（液閃計(jì)數(shù)儀），基礎(chǔ)狀態(tài)下胰島素受體底物1（IRS-1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）mRNA的表達(dá)，以及胰島素誘導(dǎo)下IRS-1磷酸化水平（免疫沉淀與免疫印跡）與GLUT4轉(zhuǎn)位（免疫印跡）變化。 （2）檢測(cè)ADMA處理后NO、ROS、腫瘤壞死因子（TNF-α）的生成（ELISA法）以及Toll樣受體4（TLR4）mRNA的表達(dá)；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察左旋精氨酸、

15、TLR4封閉抗體以及抗氧化劑維生素E能否對(duì)抗ADMA的作用。 研究結(jié)果 （1）外源性應(yīng)用ADMA（3，10μM）處理48小時(shí)可顯著降低基礎(chǔ)及胰島素誘導(dǎo)狀態(tài)下成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)2-脫氧-D-[3H]葡萄糖的攝取。 （2）ADMA（3，10μM）可下調(diào)基礎(chǔ)狀態(tài)下IRS-1與GLUT4mRNA表達(dá)。ADMA處理還可下調(diào)胰島素（lnM）誘導(dǎo)的磷酸化IRS-1蛋白含量與GLUT4蛋白表達(dá)，并抑制GLUT4從胞漿向胞

16、膜轉(zhuǎn)位。 （3）除了抑制NO生成外，ADMA10μM處理48小時(shí)可顯著促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)ROS與TNF-α生成，并且上調(diào)3T3-L1脂肪細(xì)胞中TLR4mRNA表達(dá)。應(yīng)用TLR4封閉抗體10μg/ml預(yù)處理可對(duì)抗ADMA對(duì)葡萄糖攝取及TNF-α生成。 （4）維生素E30μM預(yù)處理可促進(jìn)基礎(chǔ)及胰島素誘導(dǎo)下葡萄糖攝取，減弱ADMA對(duì)IRS-1、GLUT4的抑制作用并降低ROS、TNF-α及TLR4mRNA水平。維生素E