組蛋白H3K9甲基化轉移酶SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤增殖與分化的調控研究.pdf

1、神經(jīng)母細胞瘤是兒童常見的顱外實體腫瘤之一，約占兒童腫瘤的6-10％，年發(fā)病率大約為1/10萬，僅低于白血病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占兒童癌癥死亡的15%。神經(jīng)母細胞瘤是一種神經(jīng)內分泌性腫瘤，主要起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)嵴祖細胞，其最常見的發(fā)生部位是腎上腺，也可以發(fā)生于頸部、胸部、腹部等的神經(jīng)組織。神經(jīng)母細胞瘤臨床表現(xiàn)為惡性程度高、異質性高、易轉移、易復發(fā)以及預后差等特點，因此神經(jīng)母細胞瘤的治療比較困難，除少數(shù)可自行退化緩解或早期可完全切除

2、以外，其余病例預后較差，即使經(jīng)過多種手段聯(lián)合治療其長期生存率仍然小于40%。因此，研究神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)病機理，探索影響該腫瘤細胞增殖與分化的關鍵靶點，并闡釋這些靶點對其增殖與分化的作用機理，可以為臨床治療神經(jīng)母細胞瘤提供新策略和新方法。
　　表觀遺傳調控腫瘤細胞生長是當前研究熱點之一，許多實驗證據(jù)顯示組蛋白甲基化對腫瘤的生長增殖有著十分重要的影響。組蛋白甲基化轉移酶通過參與組蛋白甲基化，對腫瘤的生長演進起著重要的作用，因此研究組蛋

3、白甲基化轉移酶的功能及作用機制，有重要的理論及臨床價值。SETDB1是一種組蛋白甲基化轉移酶，主要參與H3K9me3的甲基化，現(xiàn)有的研究結果顯示SETDB1參與小鼠的胚胎發(fā)育，特別是對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有十分重要的影響，對腫瘤的增殖和生長也具有重要影響。但在神經(jīng)母細胞瘤中的研究尚未見報道。本研究以組蛋白甲基化轉移酶 SETDB1及神經(jīng)母細胞瘤細胞作為研究對象，利用現(xiàn)有的神經(jīng)母細胞瘤的臨床數(shù)據(jù)庫中患者的表達譜芯片數(shù)據(jù)，分析 SETDB1與神經(jīng)母

4、細胞瘤預后之間的關系。通過構建上調和下調 SETDB1的慢病毒質粒對神經(jīng)母細胞瘤進行轉染，檢測上調或下調神經(jīng)母細胞瘤細胞中SETDB1的表達水平，研究SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖分化調控作用的分子機制，為神經(jīng)母細胞瘤的臨床治療新策略提供理論依據(jù)。本研究獲得的主要研究結果如下：
　?、俳M蛋白甲基化轉移酶 SETDB1與神經(jīng)母細胞瘤預后的關系分析
　　利用神經(jīng)母細胞瘤臨床在線數(shù)據(jù)庫，檢索組蛋白甲基化轉移酶 SETDB1在神

5、經(jīng)母細胞瘤患者基因組表達譜中的表達情況，分析 SETDB1的表達量與神經(jīng)母細胞瘤預后的關系。結果顯示，SETDB1的表達量與神經(jīng)母細胞瘤患者的預后呈顯著相關，SETDB1表達量越高，患者的總體存活率越低，復發(fā)率高，預后差；反之，SETDB1表達量低，患者總體存活率高，預后較好。神經(jīng)母細胞瘤的治療效果與診斷時患兒的年齡及臨床分期有關，患兒年齡越大，分期越后，腫瘤越容易擴散，則預后越差，而患兒診斷年齡18個月被定義為決定風險的關鍵年齡節(jié)點。

6、通過分析發(fā)現(xiàn)，SETDB1隨著神經(jīng)母細胞瘤分期的進展，SETDB1表達也有差異，其中在IV（st4）期患者中 SETDB1的表達量顯著升高。在患兒診斷年齡≤18個月時，SETDB1的表達量低，在患兒診斷年齡>18個月時，SETDB1的表達量顯著增高。進一步的分析發(fā)現(xiàn)在因腫瘤致死的患者中，SETDB1的表達量顯著高于未死亡患者。同時我們發(fā)現(xiàn) SETDB1的表達量與神經(jīng)母細胞瘤原癌基因 N-MYC的擴增呈正相關，N-MYC的擴增與神經(jīng)母細胞

7、瘤的發(fā)生及復發(fā)有緊密聯(lián)系，由于神經(jīng)母細胞瘤起源于胚胎發(fā)育過程中的神經(jīng)嵴細胞，因此我們推測 SETDB1可能參與調控原癌基因或抑癌基因在胚胎發(fā)育過程中的表達，使交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調控系統(tǒng)發(fā)生紊亂，從而促使神經(jīng)母細胞瘤的形成?；谝陨戏治觯覀兺茰y SETDB1可以作為神經(jīng)母細胞瘤患者風險分層中的重要參考指標。
　　②組蛋白H3K9甲基化轉移酶SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤細胞生長增殖的影響
　　為了研究 SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤

8、細胞生長增殖的影響及其分子機制，本研究通過構建上調及下調 SETDB1的慢病毒轉染質粒，對神經(jīng)母細胞瘤感染SETDB1si慢病毒，研究下調 SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤增殖的影響。結果表明，SETDB1si干涉后，神經(jīng)母細胞瘤細胞的生長受到抑制，細胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，細胞數(shù)量明顯減少。利用 CCK8試劑盒檢測細胞增殖的生長曲線，結果顯示SETDB1si干涉后神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖基本完全被抑制。同時采用 BrdU、Ki67等增殖標記對神經(jīng)母

9、細胞瘤細胞進行免疫熒光實驗，結果發(fā)現(xiàn) SETDB1si干涉后BrdU陽性率及 Ki67陽性率都顯著降低。進一步利用流式細胞儀檢測細胞周期，結果表明下調 SETDB1引起細胞周期阻滯在 G1期。通過 Western blotting檢測Cyclin和CDK的表達顯示，SETDB1si干涉后，G1期特異性Cyclin和CDK2的蛋白表達水平明顯降低，暗示著SETDB1可能調控G1期特異性Cyclin和CDK2的表達，促使細胞周期阻滯在G1期

10、，從而抑制細胞增殖。通過軟瓊脂實驗結果顯示下調 SETDB1降低了神經(jīng)母細胞瘤的克隆形成能力，利用免疫缺陷鼠構建SETDB1si的小鼠移植模型，結果發(fā)現(xiàn)SETDB1si后的神經(jīng)母細胞瘤細胞不能在免疫缺陷鼠中長出腫瘤。為了進一步探索 SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤的增殖，我們對下調SETDB1后的細胞進行恢復SETDB1的表達實驗，結果發(fā)現(xiàn)恢復SETDB1的表達后，神經(jīng)母細胞瘤的增殖和生長、克隆形成能力及在免疫缺陷鼠體內的成瘤能力都得到了恢復

11、。這些結果表明，下調 SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤的增殖具有明顯的抑制作用。
　?、劢M蛋白H3K9甲基化轉移酶SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤嘌呤核苷酸合成的影響
　　為了探討下調 SETDB1引起神經(jīng)母細胞瘤增殖抑制的分子機制，本研究對SETDB1si干涉后的神經(jīng)母細胞瘤細胞進行表達譜分析，與對照GFPsi相比，發(fā)現(xiàn)下調SETDB1影響嘌呤代謝相關途徑。進一步的分析研究發(fā)現(xiàn)，SETDB1si干涉后嘌呤從頭合成途徑的關鍵酶基因顯著下

12、調。通過 CCK-8細胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，在SETDB1si后的神經(jīng)母細胞瘤中補償20μM的IMP，AMP，GMP之后，神經(jīng)母細胞瘤的生長得到部分恢復。嘌呤從頭合成途徑關鍵酶PRPS1作用是將5-磷酸-核糖催化生成5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP），而PRPP是嘌呤從頭合成途徑中的第一個中間產(chǎn)物。通過對PRPS1進行干涉，結果發(fā)現(xiàn)下調PRPS1也出現(xiàn)了類似下調SETDB1的效果，如細胞增殖受到抑制，細胞的克隆能力減弱等。這些結果暗示下調SETD

13、B1引起神經(jīng)母細胞瘤增殖受到抑制與SETDB1si干涉后抑制了嘌呤核苷酸合成有關。
　?、芙M蛋白H3K9甲基化轉移酶SETDB1對神經(jīng)母細胞瘤細胞分化影響的初步研究
　　有報道顯示腫瘤中存在一小群細胞，其能夠引發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展并維持腫瘤的“干性”特征，稱為腫瘤干細胞，其具有無限復制、自我更新能力以及分化潛能。臨床研究表明在低齡兒童的神經(jīng)母細胞瘤患者中，有少部分病人可以自發(fā)轉化成良性腫瘤，或者自行消退，即在極少甚至無系統(tǒng)治療的

14、情況下腫瘤縮小甚至消失的現(xiàn)象。有研究報道神經(jīng)母細胞瘤 BE(2)-C細胞可以通過維甲酸誘導向神經(jīng)元方向分化，表達神經(jīng)元標記物，如NEFL、NEFM、NEFH、MAP2、ENO2、DBH等，也可以在BrdU的誘導下向膠質細胞分化，表達膠質細胞標記（GFAP、Vimentin、ALDH1L1等）。Bmi-1、MYCN、Nestin等基因在維持神經(jīng)母細胞瘤的“干性”中扮演著十分重要的作用。在研究SETDB1的過程中，我們發(fā)現(xiàn)上調SETDB1并

15、沒顯著的增加神經(jīng)母細胞瘤的增殖能力，但是軟瓊脂實驗顯示明顯增加了神經(jīng)母細胞瘤的自我更新能力。這說明上調SETDB1增加了神經(jīng)母細胞瘤的自我更新能力。對細胞形態(tài)的的觀察發(fā)現(xiàn)，下調SETDB1引起細胞表型顯著變化，出現(xiàn)分化表型。通過對表達譜芯片數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)下調SETDB1引起了維持神經(jīng)母細胞瘤“干性”基因和神經(jīng)元標記基因的表達量下降，而神經(jīng)膠質細胞標記的表達量升高。進一步的通過熒光定量PCR檢測分析，發(fā)現(xiàn)下調SETDB1引起了神經(jīng)母細

16、胞瘤的“干性”維持基因MYCN、Bmi-1的表達量顯著下降，神經(jīng)元標記如NEFL、NEFM、NEFH、MAP2、ENO2及DBH等表達量顯著降低，但是神經(jīng)膠質細胞標記GFAP、Vimentin、ALDH1L1等表達量明顯升高。而恢復SETDB1的表達，MYCN、Bmi-1的表達得到顯著提高，神經(jīng)元標記基因NEFL、NEFM、NEFH、MAP2、ENO2及DBH等也顯著恢復，但是神經(jīng)膠質細胞標記GFAP、Vimentin、ALDH1L1顯

17、著降低。這些結果暗示下調SETDB1會促進神經(jīng)母細胞瘤向神經(jīng)膠質細胞分化。
　　以上實驗結果顯示：SETDB1si干涉后引起神經(jīng)母細胞瘤生長、增殖受到抑制，下調SETDB1抑制嘌呤核苷酸的從頭合成。 SETDB1與神經(jīng)母細胞瘤的“干性”維持密切相關，下調 SETDB1使神經(jīng)膠質細胞標記基因表達增加。SETDB1對神經(jīng)母細胞的增殖和分化具有重要的作用，這對于進一步了解神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)病機制，探索神經(jīng)母細胞瘤新的治療靶點提供了一定理論