內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)定蛋白CHERP對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控研究.pdf

1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種常見的惡性腫瘤，由兒童交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育而來，通常發(fā)生在5歲以前。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的癥狀包括腹部腫塊、疼痛、腹瀉或一般不適感。神經(jīng)母細(xì)胞瘤死亡率占兒童腫瘤相關(guān)死亡人數(shù)的12%。了解神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生和發(fā)展的確切機(jī)制，將有助于改善對這個(gè)知之甚少的腫瘤預(yù)防和治療策略。在本論文中，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)定蛋白CHERP參與調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和致瘤性等過程。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CHERP蛋白能夠引起細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而

2、導(dǎo)致DR5表達(dá)和激活，并且抑制AKT/mTOR信號通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外我們使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)特異性抑制劑GSK2606414能夠部分挽救由干擾CHERP引起的細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)表明干擾CHERP能夠觸發(fā)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)引起下游ATF4/CHOP/DR5通路激活并抑制AKT/mTOR信號通路從而誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生凋亡反應(yīng)。本研究結(jié)果表明CHERP可能為神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人臨床診斷提供潛在靶點(diǎn)并制定新的治療策略。
　　

3、本論文主要研究結(jié)果如下：
　　1.在神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人中CHERP高表達(dá)與患者預(yù)后差有關(guān)
　　為了研究CHERP的異常表達(dá)是否與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后有關(guān)，我們利用網(wǎng)絡(luò)資源R2數(shù)據(jù)庫：基因組分析和可視化平臺檢索CHERP在神經(jīng)母細(xì)胞瘤公共數(shù)據(jù)庫（Tumor Neuroblastoma public database）中表達(dá)情況。我們使用了3個(gè)常用的數(shù)據(jù)庫（Versteeg，Kocak和 Asgharzadeh），這3個(gè)數(shù)據(jù)庫分別

4、包含有88，476和247例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者，利用這3個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測CHERP與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的關(guān)系。Kaplan–Meier分析，CHERP表達(dá)量高，神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者整體存活率低，CHERP表達(dá)量低，神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者整體存活率高。其次，在Versteeg數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者死亡情況、診斷年齡和致死原因都與CHERP表達(dá)水平有關(guān)。此外，我們還分析了CHERP表達(dá)水平是否與原癌基因MYCN有聯(lián)系。結(jié)果顯示，在MYCN擴(kuò)增的患者人

5、群CHERP表達(dá)水平明顯高于非擴(kuò)增人群。這些結(jié)果暗示CHERP可能是一個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的潛在的診斷標(biāo)記。為了進(jìn)一步驗(yàn)證以上結(jié)果，我們還利用了另一個(gè)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫資源：原癌基因數(shù)據(jù)庫（Neuroblastoma Prognosis Database），Kaplan–Meier分析同樣顯示高水平的CHERP與神經(jīng)母細(xì)胞瘤不良預(yù)后有關(guān)。此外在Kocak數(shù)據(jù)庫中還發(fā)現(xiàn)，惡性程度最高的IV期腫瘤中CHERP表達(dá)水平顯著高于其他時(shí)期腫瘤。以上結(jié)果表明

6、，高水平的CHERP蛋白與神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者整體生存率及預(yù)后有關(guān)，因此我們推斷CHERP可能作為神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者診斷的一個(gè)標(biāo)志物。
　　2.CHERP在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系高表達(dá)且定位于細(xì)胞核
　　為了研究CHERP在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，我們首先利western blotting和qRT-PCR檢測了CHERP在6種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)量。我們發(fā)現(xiàn)CHERP在6種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中普遍表達(dá)，在BE(2)-C表達(dá)量最高

7、，在SHEP1細(xì)胞中表達(dá)量最低。前人研究報(bào)道顯示在大鼠肌肉細(xì)胞中CHERP與RyR1結(jié)合并定位在肌漿網(wǎng)，而最新的報(bào)道顯示在HEK293和SKBR3細(xì)胞系中CHERP扮演核蛋白作用，影響細(xì)胞增殖。為了確認(rèn)CHERP在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的具體表達(dá)位置，我們抽提了細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白。western blotting結(jié)果顯示在BE(2)-C，SK-N-DZ和SHEP13個(gè)細(xì)胞系中，CHERP只定位在細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中未能檢測到目的蛋白。進(jìn)一

8、步通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHERP只定位于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中未檢測到信號。這些結(jié)果顯示，CHERP在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中普遍表達(dá)，而且定位于細(xì)胞核內(nèi)。
　　3.干擾CHERP抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖
　　為了研究CHERP在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的中的重要性，我們應(yīng)用攜帶小發(fā)夾RNA（shRNA）的慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建了靶向干擾 CHERP的重組質(zhì)粒（CHERPsi-1＃，CHERPsi-2#和對照組GFPsi）感染BE（2）-C和SHEP1細(xì)

9、胞系。通過western blotting4.干擾CHERP誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期
　　前文數(shù)據(jù)表明干擾CHERP抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖，而許多證據(jù)表明細(xì)胞增殖往往與細(xì)胞周期有密切聯(lián)系。因此，我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了BE(2)-C和SHEP1干擾CHERP后細(xì)胞周期變化情況。結(jié)果顯示與GFPsi對照組相比，干擾CHERP能夠顯著增加G0/G1期細(xì)胞比例，S期細(xì)胞比例顯著降低。此外，我們利用增殖標(biāo)志物Ki-67去標(biāo)

10、記細(xì)胞發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CHERP干擾后Ki-67陽性細(xì)胞比例顯著降低，說明細(xì)胞增殖受到抑制。為了驗(yàn)證以上結(jié)果，我們使用western blotting檢測了G0/G1細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)相關(guān)蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾CHERP后，細(xì)胞內(nèi)CDK2和Cyclin E蛋白水平顯著降低，而CDK1，CDK4和Cyclin B1蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。這些結(jié)果證明了干擾CHERP能夠通過降低CDK2和Cyclin E表達(dá)水平從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

11、在G0/G1時(shí)期，導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖受到抑制。
　　5.干擾CHERP誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡
　　細(xì)胞凋亡可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制及腫瘤生長抑制，所以我們檢測了干擾CHERP是否導(dǎo)致誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)。首先通過Hoechst33258染色，發(fā)現(xiàn)對照GFPsi組細(xì)胞細(xì)胞核具有大而圓亮的細(xì)胞核膜，而干擾CHERP的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核出現(xiàn)亮藍(lán)色碎片，暗示干擾CHERP可能夠誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。量化細(xì)胞核碎片所占比例發(fā)現(xiàn)與GF

12、Psi組相比，干擾CHERP導(dǎo)致細(xì)胞核碎片比例大幅增加。進(jìn)一步用FITC Annexin-V和PI染色后用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)干擾CHERP后凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著的增加。下一步，我們應(yīng)用western blotting檢測了凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)干擾CHERP后Cle-caspase-3和Cle-caspase-8大幅上調(diào)。這些結(jié)果顯示了干擾CHERP能夠誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。
　　6.干擾CHERP導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞活力降低

13、及對抗腫瘤藥物敏感性增加
　　腫瘤的一大特征就是其具有耐藥性。我們接下來研究了干擾CHERP是否影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物doxorubicin（Dox）的敏感性。我們用2uM Dox處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，經(jīng)過Dox藥物處理后BE(2)-C和SHEP1細(xì)胞形成克隆明顯減少，說明干擾CHERP能夠損壞細(xì)胞對Dox的耐藥性。此外，western blotting結(jié)果也顯示，干擾CHERP后，經(jīng)過Dox處理組Cl

14、e-caspase-3和Cle-caspase-8蛋白水平顯著增加。這些結(jié)果表明干擾CHERP能夠削弱神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞藥物敏感性及降低細(xì)胞活力。
　　7.干擾CHERP抑制AKT/mTOR信號通路活性，并通過CHOP/DR5通路誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡
　　前文研究發(fā)現(xiàn)干擾CHERP能誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，增加Cle-caspase-3和Cle-caspase-8蛋白水平。文獻(xiàn)報(bào)道大部分神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞表現(xiàn)出耐藥性是由于

15、其低表達(dá)caspase-8蛋白，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體2（TRAIL-R2/DR5/TNFRSF10b）是caspase-8的一個(gè)上游調(diào)控原件。因此我們檢測了干擾CHERP蛋白后DR5表達(dá)水平變化。與我們預(yù)期結(jié)果一致，干擾CHERP后DR5蛋白水平和mRNA水平顯著增加。據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ERS）能夠誘導(dǎo)DR5轉(zhuǎn)錄翻譯。為了研究在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中DR5轉(zhuǎn)錄翻譯是否受到ERS調(diào)控，我們檢測了ERS相

16、關(guān)的標(biāo)志蛋白BIP，ATF4和CHOP。發(fā)現(xiàn)干擾CHERP，BIP，ATF4和CHOP蛋白水平顯著增加，暗示ERS參與到干擾CHERP所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。為了進(jìn)一步確認(rèn)這個(gè)結(jié)論，我們應(yīng)用了ERS特異性抑制劑GSK2606414處理細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Cle-caspase-3和Cle-caspase-8蛋白水平相對陰性對照組顯著降低，CHOP和DR5蛋白水平也有所降低。此外本研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)mTOR和AKT磷酸化水平都顯著降低，暗示AKT

17、/mTOR信號通路參與到干擾CHERP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程。這些結(jié)論暗示ERS和AKT/mTOR信號通路參與到由干擾CHERP所引起的細(xì)胞凋亡過程，并且DR5在此過程扮演重要角色。
　　8.干擾CHERP抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的體外克隆形成能力以及抑制細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力
　　為了研究干擾CHERP是否對神經(jīng)母細(xì)胞瘤成瘤能力有影響，我們首先采取了了軟瓊脂單克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示干擾CHERP后細(xì)胞形成的單克隆數(shù)目和大小都有所減小。

18、此外我們利用免疫缺陷鼠研究了CHERP與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞成瘤能力的影響，結(jié)果顯示干擾CHERP的BE(2)-C細(xì)胞在小鼠皮下未能形成腫瘤。這些結(jié)果暗示，CHERP與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞克隆形成能力和腫瘤形成能力有密切聯(lián)系。MYCN是一個(gè)經(jīng)典的原癌基因，高水平的MYCN往往與惡性神經(jīng)母細(xì)胞瘤有關(guān)，也預(yù)示著患者臨床預(yù)后不好。根據(jù)我們數(shù)據(jù)庫分析顯示，在MYCN擴(kuò)增患者人群CHERP也顯著高于非MYCN擴(kuò)增人群，為了驗(yàn)證這一結(jié)論，我們在神經(jīng)母細(xì)胞瘤