組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1調(diào)控雄性生殖干細(xì)胞存活的分子機(jī)制研究.pdf

1、具有干細(xì)胞特性的性原細(xì)胞及精原細(xì)胞統(tǒng)稱為雄性生殖干細(xì)胞，這類干細(xì)胞可以自我更新維持干細(xì)胞庫，也可以分化產(chǎn)生精子。精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是唯一可以將親本遺傳信息傳遞給后代的成體干細(xì)胞。SSCs可以分化為精原細(xì)胞并起始精子發(fā)生，這個(gè)過程需要嚴(yán)密的基因表達(dá)調(diào)控。
　　基因的表達(dá)調(diào)控受到組蛋白修飾的影響。組蛋白H3和H4的賴氨酸殘基上可以發(fā)生三種甲基化修飾，包括一、二和三甲基化。通常H3

2、K4和H3K36的甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)，而H3K9，H3K27和H4K20的甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。這些組蛋白的甲基化修飾受到甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基化酶的催化。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETDB1(SET domain，bifurcated1)，也稱為ESET，可通過H3K9me2/3調(diào)控異染色質(zhì)的形成，抑制基因表達(dá)。SETDB1對(duì)于胚胎干細(xì)胞的維持、神經(jīng)細(xì)胞的存活具有重要作用。
　　本研究利用蛋白質(zhì)免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀、組織免疫

3、熒光等技術(shù)研究了SETDB1調(diào)控小鼠精原于細(xì)胞存活的分子機(jī)制，以及SETDB1對(duì)豬性原細(xì)胞存活的調(diào)控作用。主要結(jié)果如下:
　　(1)Setdb1敲低可引起C18-4細(xì)胞線粒體膜電位的下降，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸的外翻及凋亡晚期DNA的斷裂，且Setdb1-KD誘導(dǎo)了促凋亡基因Bax、Apaf1、p53、Caspase9表達(dá)的上調(diào)，抑凋亡基因XIAP表達(dá)下調(diào)。說明Setdb1干擾可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡。
　　(

4、2)Setdb1-KD可激活PTEN，進(jìn)而抑制AKT及FOXO1的磷酸化。Setdb1及Pten的雙敲低可挽救細(xì)胞凋亡的發(fā)生，且反轉(zhuǎn)了由于Setdb1-KD誘導(dǎo)的凋亡及通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。說明了PTEN/AKT/FOXO1通路參與了Setdb1-KD誘導(dǎo)的小鼠精原干細(xì)胞凋亡。
　　(3)SETDB1可與AKT相互作用，且SETDB1可以增強(qiáng)AKT對(duì)下游靶蛋白FOXO1的調(diào)控，抑制FOXO1的入核，從而抑制其自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性

5、。Setdb1-KD可誘導(dǎo)FOXO1進(jìn)核，并激活促凋亡基因Bim和Puma的表達(dá)。說明SETDB1可以協(xié)同AKT調(diào)控FOXO1活性并影響下游靶基因的表達(dá)。
　　(4)H3K9me3-ChIP結(jié)果顯示，Setdb1-KD導(dǎo)致了基因Pten、Foxo3和Bim啟動(dòng)子區(qū)域H3K9me3水平的降低，而Foxo1、Puma、Bax和Bcl2啟動(dòng)子區(qū)域的H3K9me3無顯著變化。另外，SETDB1-ChIP顯示，SETDB1可以直接結(jié)合到Pt

6、en、Bim、Puma和Bax基因啟動(dòng)子區(qū)域。結(jié)果說明，SETDB1只負(fù)責(zé)部分基因啟動(dòng)子上H3K9me3修飾，且SETDB1可以通過直接作用于Pten及Bim啟動(dòng)子區(qū)域催化H3K9me3修飾，從而調(diào)控小鼠精原干細(xì)胞的存活。
　　(5)在豬睪丸發(fā)育過程中，，ETDB1的表達(dá)量隨著豬的發(fā)育逐漸升高，而H3K9me3的表達(dá)水平在出生7天豬睪丸中表達(dá)量最高。在7天和兩月齡豬的睪丸組織中，SETDB1在性原細(xì)胞和精原干細(xì)胞中呈胞質(zhì)分布，而H

7、3K9me3呈核周分布。在成年豬睪丸組織中，SETDB1定位于精原干細(xì)胞和分化的精原細(xì)胞的細(xì)胞核，而H3K9me3在精原干細(xì)胞中呈核周分布，在分化的精原細(xì)胞中呈斑點(diǎn)狀分布。
　　(6)為了研究SETDB1在豬性原細(xì)胞中的功能，通過差異貼壁富集性原細(xì)胞，富集后的性原細(xì)胞純度可達(dá)到76.5％±3.9％。通過Western及RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SETDB1主要表達(dá)于性原細(xì)胞。說明SETDB1在調(diào)控豬性原細(xì)胞的存活上可能發(fā)揮著重要功能。

8、
　　(7)SETDB1干擾引起豬性原細(xì)胞凋亡，且凋亡的發(fā)生不依賴于H3K9me3;另外，SETDB1可與催化H3K27甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2結(jié)合，且SETDB1敲低引起H3K27me3水平的降低，說明SETDB1干擾調(diào)控豬性原細(xì)胞的凋亡是通過H3K27me3水平調(diào)控的。
　　綜上所述，通過PTEN/AKT/FOXO1通路及H3K9me3水平，Setdb1-KD誘導(dǎo)小鼠精原干細(xì)胞的凋亡;SETDB1協(xié)同AKT參與對(duì)下游靶