DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1在胰腺癌DNA甲基化中作用機(jī)制的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:基于研究現(xiàn)狀,本課題將DNMT1作為研究切入點(diǎn),首先,研究DNMT1在胰腺癌中的表達(dá)情況及其與臨床和病理的相關(guān)性,評(píng)價(jià)其在胰腺癌中患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及早期診斷中的價(jià)值;其次,利用RNA干擾技術(shù)沉默DNMT1基因,觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響;第三,檢測(cè)沉默DNMT1基因?qū)σ认侔┘?xì)胞DNMT酶活性和DNA甲基化的影響,深入探討DNMT1 siRNA干擾抗腫瘤的分子機(jī)制。本研究包括五部分內(nèi)容,分述如下。 一、人胰腺癌

2、組織中DNMTs基因的表達(dá) 目的:檢測(cè)在正常胰腺組織、胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中DNMTs基因mRNA的表達(dá)情況,探討DNMTs在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法:收集22例手術(shù)切除的腆腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織和5例正常胰腺組織,采用Real-time RT-PCR法(SYBR GREEN法)檢測(cè)上述來(lái)源組織中DNMTs基因mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果:以正常胰腺組織為對(duì)照,22例胰腺癌組織和癌旁組織中DNMT1 mR

3、NA的相對(duì)表達(dá)量分別為2.32(1.17-5.17)和0.78(0.07-3.14),DNMT3a mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為9.41(0.38-41.95)和2.00(0.22-24.88),DNMT3b mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為7.78(0.36-43.78)和4.23(0.12-18.51)。 結(jié)論:胰腺癌組織中DNMT1,DNMT3a和DNMT3b mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁組織,表明DNMTs基因的異常激活可能在胰腺

4、癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。 二、人胰腺癌組織中DNMT1蛋白表達(dá)與臨床和病理的相關(guān)性研究 目的:檢測(cè)DNMT1蛋白在人胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況,分析胰腺癌及癌旁組織中DNMT1蛋白表達(dá)水平與臨床和病理的相關(guān)性。 方法:采用鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化酶(streptavidin peroxidase,SP)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胰腺癌和相應(yīng)癌旁組織中DNMT1蛋白表達(dá)。 結(jié)果: DNMT1在胰腺導(dǎo)管

5、細(xì)胞癌細(xì)胞核染色,陽(yáng)性細(xì)胞為棕黃色。胰腺癌中DNMT1表達(dá)陽(yáng)性率54.5%±21.2%。結(jié)果提示DNMT1表達(dá)強(qiáng)度和臨床分期(X2=6.897,P=0.029)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(X2=4.739,P=0.029)、神經(jīng)浸潤(rùn)與否(X2=5.44,P=0.020)相關(guān),而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小、腫瘤分化、血清CEA和CA199濃度無(wú)關(guān)。 結(jié)論:DNMT1蛋白在胰腺痛組織中表達(dá)明顯較胰腺癌旁組織高,胰腺癌組織中DNMT1高表達(dá)在

6、胰腺痛的侵襲力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤(rùn)中起到重要的作用。 三、DNMT1 siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞DNA甲基化的影響 目的:檢測(cè)DNMT1 siRNA干擾對(duì)胰腺癌細(xì)胞株DNMT酶活性的作用,明確DNMT1 siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞株DNA甲基化水平的影響。 方法:采用Real-time RT-PCR和Western-blot法分別檢測(cè)各組細(xì)胞DNMT1基因和蛋白表達(dá)的變化,評(píng)價(jià)DNMT1 siRNA干擾的沉默效率;采用

7、DNMT酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)DNMT1 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞DNMT酶活性的影響;轉(zhuǎn)染48h后提取各組細(xì)胞DNA,并進(jìn)行亞硫酸鹽處理。 結(jié)果:Real-time RT-PCR檢測(cè)顯示有顯著性差異。 結(jié)論:DNMT1 siRNA能特異性、高效抑制胰腺癌細(xì)胞DNMT1 mRNA及蛋白的表達(dá);DNMT1 siRNA干擾能顯著降低胰腺癌PaTu8988細(xì)胞DNMT酶活性,并能使胰腺癌細(xì)胞hMLH1和RAR-β基因啟動(dòng)子部分去

8、甲基化。 四、DNMT1 siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響 目的:探討DNMT1 siRNA靶向性沉默DNMT1基因?qū)θ艘认侔┘?xì)胞增殖、細(xì)胞周期及其相關(guān)基因CDKN1A mRNA的影響,明確DNMT1 siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。 方法:采用脂質(zhì)體法DNMT1 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胰腺癌PaTu8988細(xì)胞。采用WST-8法測(cè)定各組胰腺癌細(xì)胞的增殖情況;應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DNMT1 siRNA

9、干擾對(duì)胰腺癌細(xì)胞周期的影響;采用Real-time RT-PCR檢測(cè)DNMT1 siRNA干擾對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因CDKN1A mRNA水平的影響。 結(jié)果:WST-8法檢測(cè)顯示siRNA干擾48h后,陰性siRNA(15nM)組、陰性siRNA(30nM)組、DNMT1 siRNA(15nM)組和DNMT1 siRNA(30nM)組的細(xì)胞存活率分別為86.3%±8.2%,76.6%±7.3%,82.9%±5.8%和63.1%±14

10、.2%,均低于空白對(duì)照組的100%±12.0%(P<0.01);DNMT1 siRNA(30nM)組的細(xì)胞存活率明顯低于空白對(duì)照組、陰性siRNA(15nM)組和陰性siRNA(30nM)組、DNMT1 siRNA(15nM組)(P<0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示DNMT1 siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組均出現(xiàn)G2/M期細(xì)胞百分率顯著低于空白對(duì)照組、陰性siRNA(15nM)組和陰性siRNA(30nM)組

11、(均P<0.05)。siRNA干擾后,DNMT1 siRNA(30nM)組CDKN1A基因mRNA相對(duì)表達(dá)量(RQ=54.918±5.774)明顯高于空白對(duì)照組(RQ=1.050±0.363)、陰性siRNA(15nM)組(RQ=5.185±0.165)、陰性siRNA(30nM)組(RQ=7.352±0.074)和DNMT1 siRNA(30nM)組(RQ=5.761±0.271)(均P<0.05)。 結(jié)論:轉(zhuǎn)染DNMT1 s

12、iRNA能誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞G2/M期細(xì)胞周期阻滯,抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖;同時(shí),上調(diào)了細(xì)胞周期相關(guān)基因CDKN1AmRNA的表達(dá)。 五、DNMT1 siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因的影響 目的:探討DNMT1 siRNA靶向性沉默DNMT1基因?qū)θ艘认侔┘?xì)胞凋亡及其相關(guān)基因Bel-2和Bax mRNA表達(dá)的影響,明確DNMT1 siRNA對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡影響的分子機(jī)制。 方法:采用脂質(zhì)體法DNMT1 siRNA瞬

13、時(shí)轉(zhuǎn)染人胰腺癌PaTu8988細(xì)胞。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DNMT1 siRNA干擾對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響:采用Real-time RT-PCR檢測(cè)DNMT1 siRNA干擾對(duì)抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax mRNA水平的影響。 結(jié)果:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示空白對(duì)照組、陰性siRNA(15nM)組、陰性siRNA(30nM)組和DNMT1(15nM)組細(xì)胞凋亡率分別為7.51%±1.12%、9.45%±0.98%、8.84%±

14、1.44%和10.01%±0.66%,各組間無(wú)顯著性差異。DNMT1 siRNA組的凋亡率為14.94%±2.89%,較其他各組明顯升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);siRNA干擾48h后,空白對(duì)照組、陰性siRNA(15nM)組、陰性siRNA(30nM)組、DNMT1 siRNA組(15nM)和DNMT1 siRNA組(30nM)的抗凋亡基因Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(RQ)依次為1.004±0.108,0.817±0.074

15、,0.672±0.016,0.522±0.050,1.143±0.386,各組間無(wú)顯著性差異;DNMT1 siRNA組促凋亡基因Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量(RQ=8.000±0.579)明顯高于空白對(duì)照組(RQ=1.021±0.219)、陰性siRNA(15nM)組(RQ=1.372±0.199)、陰性siRNA(30nM)(RQ=2.636±0.387)和DNMT1 siRNA組(15nM)(RQ=1.316±0.116)(P<0.0

16、5)。 結(jié)論:轉(zhuǎn)染DNMT1 siRNA能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡增加,其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)。 本課題結(jié)論: 1、胰腺癌組織中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA較胰腺癌癌旁組織表達(dá)高。 2、DNMT1蛋白在胰腺癌組織表達(dá)明顯高于癌旁組織,胰腺癌組織中DNMT1高表達(dá)與胰腺癌的侵襲力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤(rùn)相關(guān)。 3、DNMT1 siRNA干擾能顯著降低胰腺癌細(xì)胞的DN

17、MT酶活性,并能使胰腺癌細(xì)胞hMLH1和RAR-β基因啟動(dòng)子CpG島部分去甲基化。 4、DNMT1 siRNA干擾抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),促使胰腺癌細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期細(xì)胞周期阻滯,上調(diào)了細(xì)胞周期相關(guān)基因CDKN1A的表達(dá)。 5、DNMT1 siRNA干擾能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡增加,其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)。 全文總結(jié):DNMT家族在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。其中,DNMT1的活性與多種

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