DOT1L抑制劑對(duì)豬著床前克隆胚體外發(fā)育及H3K79二甲基化重編程的影響.pdf

1、豬的體細(xì)胞核移植(克隆)技術(shù)在種質(zhì)資源保護(hù)、良種繁育，人類器官移植異種供體和疾病模型制備、輔助生殖技術(shù)質(zhì)控、藥物蛋白生產(chǎn)，以及生殖與發(fā)育基礎(chǔ)研究等方面的成功應(yīng)用，顯示出其在畜牧業(yè)、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，由供體細(xì)胞核表觀遺傳重編程不徹底等因素所導(dǎo)致的豬體細(xì)胞克隆效率低下，極大地限制了該技術(shù)的進(jìn)一步推廣。表觀遺傳學(xué)事件主要包括DN A甲基化和組蛋白修飾，其中后者又包括組蛋白的甲基化、乙?；?、糖基化、磷酸化、泛素化和SU

2、MO化等。研究顯示，利用恰當(dāng)?shù)腄N A甲基化/去甲基化表觀遺傳修飾劑處理供核細(xì)胞或者克隆胚胎，可顯著改善重編程并提高克隆效率。借助 H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶 DOT1L特異性抑制劑 EPZ004777(EPZ)干預(yù)，可促進(jìn)小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的獲取效率及質(zhì)量提高，表明 H3K79二甲基化(H3K79me2)可能參與調(diào)控細(xì)胞多能性。那么，H3K79me2是否參與了著床前克隆胚發(fā)育調(diào)控目前未見報(bào)道。因此，本研究以豬為研究對(duì)象，首先試圖揭示豬 H3

3、K79me2在豬克隆胚早期發(fā)育期間的動(dòng)態(tài)變化，再結(jié)合EPZ處理，探討表觀修飾劑干預(yù) H3K79me2重編程對(duì)豬克隆胚發(fā)育的影響，為今后最終闡明 H3K79me2參與細(xì)胞發(fā)育命運(yùn)調(diào)控的分子機(jī)制提供依據(jù)。具體試驗(yàn)和結(jié)果如下：
　　試驗(yàn)一旨在揭示豬胚胎著床前發(fā)育期間 H3K79me2的重編程規(guī)律。以相應(yīng)發(fā)育時(shí)期的豬體外受精胚胎(in vitrofertilization, IVF)為對(duì)照，利用H3K79me2抗體的間接免疫熒光技術(shù)，檢測

4、了不同發(fā)育階段的豬體細(xì)胞克隆(SCNT)胚胎中 H3K79me2的信號(hào)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在豬IVF和SCNT胚胎中，H3K79me2信號(hào)均在起點(diǎn)到原核胚期間從較高水平顯著降低至消失，至桑椹胚信號(hào)重新出現(xiàn)，囊胚期進(jìn)一步增強(qiáng)。所不同的是，在IVF胚胎中EXPB到HB階段H3K79me2表達(dá)水平趨于平緩，而在SCNT胚胎中從 EXPB到 HB階段 H3K79me2表達(dá)水平依然持續(xù)上升。另外，從原核期(16hpa NTE和18hpi IVFE)至

5、8-cell階段，H3K79me2在兩種胚胎中的信號(hào)均降至最低點(diǎn)，而在起始階段和桑椹胚之后IVFE中的H3K79me2信號(hào)水平均高于NTE。結(jié)果表明，豬體細(xì)胞克隆胚著床前發(fā)育期間H3K79me2重編程異常。
　　試驗(yàn)二目的是探討EPZ對(duì)豬SCNT胚胎著床前體外發(fā)育的影響，將SCNT胚隨機(jī)置于分別添加0.5nM、5nM、50nMEPZ的PZM-3和1‰ DMSO(v/v)的PZM-3(對(duì)照組)自化學(xué)激活起處理24 h，根據(jù)各組胚胎的

6、卵裂率、囊胚率及囊胚總細(xì)胞數(shù)來評(píng)價(jià)其效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各組卵裂率無差異；0.5nM組囊胚率顯著高于對(duì)照組(28.97±2.65％ vs.17.13±2.69%)；就囊胚總細(xì)胞數(shù)而言，各組均無明顯變化，但50nM組有降低的趨勢。隨后，選取含0.5nM EPZ的PZM-3，自化學(xué)激活起，分別孵育豬克隆胚胎12h、24h、36h(對(duì)照組處理0h)。結(jié)果顯示，各組卵裂率無顯著差異，而12h和24h處理組的囊胚率均顯著提高(28.56±3.51%，

7、28.34±3.00% vs.16.32±1.93%，17.93±0.64%)。在囊胚總細(xì)胞數(shù)上，除36 h處理組顯著降低外，其余三組之間無差異。以上結(jié)果說明，0.5nM EPZ處理12-24h可改善豬克隆胚胎的早期發(fā)育，而處理濃度過高或時(shí)間過長都可能損害胚胎發(fā)育。
　　試驗(yàn)三旨在探明EPZ是否是通過調(diào)節(jié) H3K79me2重編程，進(jìn)而有助于豬SCNT胚胎原核期H3K79me2重編程。以IVF胚胎和未經(jīng)EPZ處理的各期SCNT胚胎為

8、對(duì)照，在0.5nM EPZ處理后，檢測了1-細(xì)胞發(fā)育不同時(shí)期的SCNT胚胎其H3K79me2變化，以及處理4 h后重構(gòu)胚 DOT1L基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IVF胚胎中，H3K79me2水平在受精后4h內(nèi)迅速降低，6hpi進(jìn)一步降低，至10hpi信號(hào)消失；對(duì)照組H3K79me2的水平從電刺激活至4hpa階段緩慢降低，到8hpa信號(hào)消失；而經(jīng)EPZ處理組胚胎H3K79me2水平則從2hpa開始降低，4hpa繼續(xù)下降，至8hpa信號(hào)消失。

9、DOT1L基因在0.5nM EPZ處理組中表達(dá)量較對(duì)照組有所降低，但不顯著。結(jié)果表明，0.5nM EPZ處理部分抑制了DOT1L基因的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)H3K79me2水平，改善了SCNT胚胎的H3K79重編程，從而有助于克隆胚的著床前發(fā)育。
　　試驗(yàn)四的目的是進(jìn)一步明晰EPZ促進(jìn)豬SCNT胚胎體外發(fā)育的可能分子機(jī)制。檢測了0.5nM EPZ處理12h和24h后發(fā)育而來的豬SCNT囊胚不同時(shí)期(根據(jù)其形態(tài)分為EB、EXPB以及HB)

10、H3K79me2水平，與IVF囊胚、非EPZ處理的SCNT囊胚相應(yīng)階段H3K79me2比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EPZ處理后，SCNT囊胚中H3K79me2水平變化趨勢大體上與非EPZ處理的SCNT囊胚一致，雖然比非EZP組有所增加，但還達(dá)不到IVF囊胚的H3K79me2水平。之后檢測了EPZ處理12h、24h來源 SCNT囊胚及對(duì)照組 SCNT囊胚中相關(guān)基因(自我更新基因 OCT4、SOX2、LIN28以及分化基因CDX2、GATA4)的表達(dá)

11、。結(jié)果顯示，在源于EPZ處理的SCNT囊胚中，OCT4、CDX2和GATA4表達(dá)量均顯著上調(diào)；SOX2在12h處理組中顯著高于對(duì)照組，24h組與對(duì)照組相比無明顯差異，Lin28則相反。兩處理組來源的囊胚，其CDX2和GATA4無差異；SOX2和LIN28在處理12h組中顯著高于24 h組，OCT4則相反。
　　綜上所述，本文首次對(duì)豬SCNT和IVF胚胎著床前發(fā)育期間H3K79me2重編程規(guī)律進(jìn)行了研究，揭示了H3K79me2在豬早