膿毒癥患者外周血白細(xì)胞中組蛋白甲基化修飾的研究.pdf

1、膿毒癥是感染因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，如得不到及時控制，可引起多個臟器功能障礙。膿毒癥的發(fā)生率高，且逐年上升，已經(jīng)成為導(dǎo)致危重患者死亡的主要原因。膿毒癥的發(fā)病涉及白細(xì)胞為主的多種炎癥細(xì)胞所致的過度炎癥反應(yīng)，但具體調(diào)控機制未明。組蛋白甲基化是重要的表觀遺傳修飾方式，參與基因表達(dá)調(diào)控等重要的細(xì)胞功能，與胚胎發(fā)育與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。一般情況下，組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)、H3K36和H3K79的甲基化調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活，而H3K9、

2、H3K27與H4K20的甲基化則調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄抑制。新近細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn):組蛋白H3K4、H3K9、H3K27的甲基化與炎癥/感染也密切相關(guān)。為了探索這些組蛋白甲基化修飾在臨床患者膿毒癥進(jìn)程中的作用，我們抽取患者的外周血，分離獲取白細(xì)胞;首先建立并優(yōu)化外周血白細(xì)胞免疫熒光染色方法，從而能夠觀察不同白細(xì)胞中組蛋白甲基化水平。然后分別選擇創(chuàng)傷與食管癌術(shù)后患者為研究對象，分析膿毒癥對兩類患者外周血不同白細(xì)胞中組蛋白甲基化修飾的影響，以期獲得組蛋白

3、甲基化參與調(diào)控膿毒癥的臨床證據(jù)，為臨床患者尋找早期預(yù)測與判斷炎癥/感染進(jìn)程的表觀遺傳學(xué)新指標(biāo)。
　　本研究包括兩部分內(nèi)容:
　　第一部分:人外周血白細(xì)胞免疫熒光染色方法的建立與優(yōu)化。外周血細(xì)胞中白細(xì)胞數(shù)量最少，其中包括中性粒細(xì)胞(Neu)、淋巴細(xì)胞(Lyme)、單核細(xì)胞(Mon)等多種含量各異的白細(xì)胞，參與機體抗感染、炎癥以及免疫反應(yīng)等重要功能。體外白細(xì)胞生存期短，又呈懸浮狀態(tài)存在而難于固定，因而極大限制了各種特異性抗體依賴

4、的免疫檢測技術(shù)的應(yīng)用。針對這個難點問題，我們通過采血后盡早快速分離白細(xì)胞，摸索最佳的白細(xì)胞凍存與復(fù)蘇條件，以獲得盡可能多的存活白細(xì)胞;再通過懸浮液與固定玻片的選擇，觀察比較懸浮法、血涂片法以及滴片法處理白細(xì)胞，對最終免疫熒光染色效果的影響，尋找最佳的白細(xì)胞固定條件，建立和優(yōu)化外周血白細(xì)胞的免疫熒光染色技術(shù)。
　　第二部分:膿毒癥患者外周血白細(xì)胞組蛋白甲基化修飾的研究。我們分別選擇創(chuàng)傷與食管癌術(shù)后患者為研究對象，用已經(jīng)建立優(yōu)化的外周

5、血白細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)，以共染色293T細(xì)胞的熒光強度為基準(zhǔn)，對Neu、Lym及Mon三種白細(xì)胞中組蛋白甲基化修飾的染色進(jìn)行相對定量分析。初步結(jié)果表明:雖然膿毒癥可使創(chuàng)傷患者外周血三種白細(xì)胞中H3K9二甲基化修飾均升高，但與單純創(chuàng)傷患者相比差異并無顯著性;而并發(fā)膿毒癥卻可使食管癌術(shù)后患者三種白細(xì)胞中已經(jīng)升高的H3K9二甲基化水平降低?？梢姡摱景Y對于創(chuàng)傷與食管癌術(shù)后患者的影響不同，這可能與腫瘤患者已經(jīng)存在的組蛋白甲基化修飾異常有關(guān)，提