內(nèi)毒素血癥過程中組蛋白的甲基化修飾及其對(duì)炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控.pdf

1、革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria)感染時(shí)，細(xì)菌的細(xì)胞壁成份-內(nèi)毒素(endotoxin)，或稱為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)被釋放入血。釋放入血的LPS能廣泛作用于免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(TNFα)、白介素6(IL-6)、白介素1(IL-1)、干擾素(INF)、一氧化氮(NO)、血小板活化因子等，即“細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)”，進(jìn)而引起失控性炎

2、癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起內(nèi)毒素休克、組織損傷，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為多器官功能障礙(mutiple organ dysfunction)。目前，對(duì)于內(nèi)毒素血癥的治療方案主要有抗生素、抗內(nèi)毒素抗體、炎性介質(zhì)拮抗劑、傳統(tǒng)中醫(yī)藥以及血液凈化等，但均有不足，如療效并不顯著，或副作用比較大。因此，探索和認(rèn)識(shí)內(nèi)毒素血癥的確切發(fā)病機(jī)制和干預(yù)措施，對(duì)防治內(nèi)毒素休克及MODS具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
　　 LPS通過TLR4及其介導(dǎo)的信號(hào)通路激活細(xì)胞，

3、誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)。在這些表達(dá)產(chǎn)物中，不僅有促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子，還有趨化因子、抗微生物的蛋白、組織修復(fù)因子、代謝調(diào)控因子和獲得性免疫的調(diào)控因子。這些產(chǎn)物的功能不同，對(duì)組織損傷及內(nèi)環(huán)境的影響也有不同。例如，促炎細(xì)胞因子和抗微生物的蛋白對(duì)保護(hù)性免疫反應(yīng)來說非常關(guān)鍵，但是，如前所述，持續(xù)或過度產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)及休克，而過度產(chǎn)生的抵抗微生物的蛋白對(duì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性影響非常小。所以，為了免受致病菌的感染，在炎癥反應(yīng)過

4、程中需要對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控，既要控制促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生，以避免對(duì)組織的損傷;又要持續(xù)不斷地產(chǎn)生抗微生物的蛋白，防止微生物的入侵。
　　 然而，這些具有不同功能的基因都受到同一個(gè)受體(TLR4)及其介導(dǎo)信號(hào)通路的調(diào)控，并且還發(fā)生在同一種細(xì)胞類型（如巨噬細(xì)胞）中，因此其調(diào)節(jié)必然要求下游水平的差異調(diào)控，以達(dá)到選擇性表達(dá)或沉默功能相同基因的目的。這一調(diào)節(jié)不影響受到相同受體誘導(dǎo)的其它基因的激活或抑制，是一種基因特異性的調(diào)控。<

5、br>　　 基因的特異性調(diào)控主要是在組蛋白修飾水平實(shí)現(xiàn)的。組蛋白修飾包括多種修飾方式，如賴氨酸甲基化、乙酰化，絲氨酸磷酸化，泛素化，糖基化等。這些修飾參與調(diào)控許多細(xì)胞生物學(xué)過程，包括基因表達(dá)、有絲分裂、細(xì)胞分化、X染色體失活以及基因印記等。調(diào)控組蛋白修飾的有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶、組蛋白去乙?；敢约斑@些酶相關(guān)的蛋白復(fù)合體等。在這些酶及相關(guān)蛋白復(fù)合體的作用下，組蛋白的修飾發(fā)生改變，并可影響高度有序的染色質(zhì)

6、結(jié)構(gòu)和參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，這一調(diào)節(jié)主要體現(xiàn)在:①通過乙?；?去乙?；淖兘M蛋白N端的電荷從而改變組蛋白和DNA的緊密程度;②形成一處有高親和力的位點(diǎn)，這一位點(diǎn)可以募集到具有局部重構(gòu)染色質(zhì)作用的非組蛋白效應(yīng)蛋白及復(fù)合體。
　　 對(duì)內(nèi)毒素耐受(endotoxin tolerance)機(jī)制的深入研究證實(shí)了基因特異性調(diào)控這一觀點(diǎn)。內(nèi)毒素耐受是指動(dòng)物或體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞在給予LPS預(yù)處理后，再次給予LPS刺激時(shí)對(duì)LPS的反應(yīng)降低，在動(dòng)

7、物模型中表現(xiàn)為動(dòng)物死亡率降低，細(xì)胞因子如TNFα、IL-6和IL-1的釋放減少，但是與抗菌能力相關(guān)的分子如內(nèi)生性致熱原增加等;而離體巨噬/單核細(xì)胞則表現(xiàn)為L(zhǎng)PS引起的補(bǔ)體受體3(complement receptor type3)和FcⅢ/Ⅱ受體表達(dá)上調(diào)，Cnlp(cathelicidin-related antimicrobial peptide)表達(dá)亦增加。由于這兩類基因的誘導(dǎo)表達(dá)均依賴TLR及其介導(dǎo)的信號(hào)通路，因此推測(cè)它們的表達(dá)是

8、受基因特異(gene-specific)而不是信號(hào)通路特異(signal-specific)機(jī)制的調(diào)控。
　　 為了弄清調(diào)控這兩類功能不同基因的特異性機(jī)制，F(xiàn)oster等人按照功能和調(diào)節(jié)需要，將TLR誘導(dǎo)的基因分為兩類。第一類基因，耐受性(tolerizable)基因，在耐受的巨噬細(xì)胞受到LPS刺激時(shí)不能被再次誘導(dǎo);第二類基因，非耐受性(non-toleriza ble)基因，在耐受的巨噬細(xì)胞中仍然可以被誘導(dǎo)。研究發(fā)現(xiàn)，耐受性基

9、因包括了多種炎癥介質(zhì)，而非耐受性基因包含了抗微生物因子、病原體識(shí)別受體、趨化因子和非直接引起組織損傷的其它基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這兩類基因的誘導(dǎo)表達(dá)需要不同的組蛋白修飾模式。正常巨噬細(xì)胞受到LPS刺激時(shí)，上述兩類基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白4(H4)均發(fā)生了乙?；?，但是只有非耐受性的基因在受到LPS的再次刺激后其啟動(dòng)子部位的H4再次發(fā)生了乙?；?。在內(nèi)毒素耐受的巨噬細(xì)胞，非耐受性基因啟動(dòng)子部位組蛋白乙?；降膭?dòng)態(tài)變化反映了基因表達(dá)水平的變化:即

10、耐受的細(xì)胞在受到再次刺激前，與正常細(xì)胞相比其非耐受性基因啟動(dòng)子處組蛋白乙酰化的水平保持在相對(duì)較高的水平;受到刺激后乙?；竭M(jìn)一步升高，甚至升得更快和更高。因此，可耐受性基因和不可耐受性基因其組蛋白的乙?；癄顟B(tài)直接與它們的轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。上述結(jié)果表明炎癥細(xì)胞是可以通過組蛋白修飾調(diào)控特定基因的表達(dá)狀態(tài)，如激活還是沉默。
　　 對(duì)基因特異性調(diào)控的認(rèn)識(shí)，使我們開始反思現(xiàn)有一些抗炎藥物治療效果不佳或者副作用過大的原因。由于過度或持續(xù)炎癥反

11、應(yīng)對(duì)組織造成的損害主要由炎癥介質(zhì)的過度釋放引起，而炎癥介質(zhì)的過度釋放與相關(guān)信號(hào)通路激活有關(guān)，因此人們一直把注意力放在如何有效調(diào)控信號(hào)通路上，即試圖通過抑制信號(hào)通路控制炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生，其結(jié)果是同時(shí)抑制了抗微生物多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，使病人對(duì)感染的易感性增加，并且由于對(duì)其他保護(hù)反應(yīng)如代謝和組織修復(fù)等的抑制而產(chǎn)生了很大的副作用。所以，探討組蛋白修飾在基因特異性調(diào)控中的作用，不僅有助于闡明內(nèi)毒素休克及炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制，而且為今后尋求更

12、為有效、合理的抗炎藥物具有積極的指導(dǎo)作用。
　　 基于上述認(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)室前期利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了小鼠內(nèi)毒素休克后肝臟組織的核蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)組蛋白成員的等電點(diǎn)發(fā)生了顯著酸化，這些變化多數(shù)發(fā)生在LPS刺激后的30 min和3h時(shí)間點(diǎn)。組蛋白等電點(diǎn)的酸化主要與組蛋白的翻譯后修飾有關(guān)，這些修飾主要包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，經(jīng)過修飾的組蛋白可改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)其下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

13、>　　 因此，本實(shí)驗(yàn)的主要目的是研究在內(nèi)毒素血癥中有哪些組蛋白修飾受到影響，探索調(diào)控炎癥因子轉(zhuǎn)錄的組蛋白修飾。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分:
　　 第一部分:檢測(cè)LPS刺激巨噬細(xì)胞后組蛋白H3的K4、K9、K27、K36、K79，組蛋白H4的K20位點(diǎn)處甲基化以及H3、H4泛乙酰化的變化情況。
　　 第二部分:探討在第一部分實(shí)驗(yàn)中變化較明顯的修飾是否參與了炎癥因子IL-6和TNFα的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:

14、
　　 1.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用LPS(100μg/L)刺激巨噬細(xì)胞（RAW264.7細(xì)胞和BMM細(xì)胞）0.5 h、1h、2h、3h、6h后，與未刺激對(duì)照組(0 h)相比，H3K4me2/3、H3K9me2/3、H3K27me2、H3K36me2、H3K79me2、H4K20me3、H3乙?；?、H4乙?；加胁煌潭鹊脑鰪?qiáng)，其中，H3K4me2/3和H3K9me2/3增強(qiáng)明顯;H3K4me1、H3K9泛甲基化

15、、H4K20me1/2無明顯變化。
　　 2.由于H3K4me2和H3K9me2在LPS刺激巨噬細(xì)胞后0.5 h明顯增強(qiáng)，故選擇這兩種修飾位點(diǎn)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。分別用H3K4me2和H3K9me2的抗體富集與H3K4me2和H3K9me2位點(diǎn)結(jié)合的DNA(ChlP實(shí)驗(yàn))，用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與H3K4me2和H3K9me2位點(diǎn)結(jié)合的IL-6和TNFα基因啟動(dòng)子的情況。結(jié)果顯示，LPS(100μg/L)刺激RAW264.7細(xì)胞0

16、.5 h后，H3K4me2與IL-6和TNFα基因啟動(dòng)子結(jié)合增強(qiáng)，分別是對(duì)照組的121.8、5.46倍;H3K9me2與IL-6和TNFα基因啟動(dòng)子的結(jié)合沒有增強(qiáng)。
　　 3.為了進(jìn)一步明確H3K4me2修飾是否參與了IL-6和TNFα的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)用組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 MTA(5'-Deoxy-tp-(methylthio)adenosine)抑制H3K4me2/3的修飾然后檢測(cè)其對(duì)IL-6和TNFα mRNA水平

17、有無影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用MTA(0.25mmol/L、0.5mmol/L、1 mmol/L)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和Western Blot均顯示H3K4me2/3修飾受到抑制;進(jìn)一步用熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H3K4me2/3被抑制后IL-6和TNFα的mRNA水平降低，其中，當(dāng)MTA預(yù)處理濃度為0.5mmol/L時(shí)，與單獨(dú)LPS刺激后相比，IL-6的mRNA水平降低了47％，TNFα的mRNA水平降低了48％

18、;當(dāng)MTA預(yù)處理濃度為1 mmol/L時(shí)，IL-6的mRNA水平降低了90％，TNFα的mRNA水平降低了78％。IL-6和TNFα mRNA水平的改變具有MTA濃度依賴性。
　　 根據(jù)以上結(jié)果，得到以下初步結(jié)論:
　　 1.在內(nèi)毒素血癥的發(fā)生發(fā)展過程中，H3K4me2/3、H3K9me2/3、H3K27me2、H3K36me2、H3K79me2、H4乙酰化發(fā)生了改變，且隨著時(shí)間的變化而動(dòng)態(tài)變化。H3K4me2和H3K9