ADAM8對巨噬細胞功能的影響及其肽抑制劑治療哮喘動物模型的研究.pdf

1、哮喘病是一種常見的慢性呼吸道疾病,更是對人類健康最具危害的非傳染性重大疾病之一。然而哮喘的發(fā)病機制至今尚未被完全揭示,這也是臨床上對哮喘始終缺乏有效治愈方法的根本原因。一般認為哮喘病理機制涉及氣道炎癥、氣道組織重構(gòu)和氣道高反應性(Airway Hyperresponsiveness,AHR)等諸多復雜因素。在這些病理因素中,氣道炎癥被認為是哮喘發(fā)病的重要病理基礎,其最顯著的特征是氣道內(nèi)存在大量炎癥細胞的浸潤。因此,炎癥細胞從血管系統(tǒng)中被

2、招募并遷移至氣道的過程,對于哮喘氣道炎癥乃至整個哮喘的發(fā)病是至關重要的,但這一過程的調(diào)控機制尚未被解釋清楚。已有相關研究提示,解整合素金屬蛋白酶8(A Disintegrin and Metalloprotease 8,ADAM8)在這個過程中扮演著重要的角色:ADAM8被證實是一個與中度到重度過敏性哮喘極為相關的哮喘易感基因,其mRNA的表達在哮喘患者的唾液、支氣管活檢組織和卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)致敏性哮喘小鼠的肺組織

3、中被發(fā)現(xiàn)有顯著增高;ADAM8可被炎癥刺激物誘導表達,且在體外被證實可參與多種炎癥因子、細胞粘附因子和細胞外基質(zhì)蛋白的催化或降解;由于ADAM8在哮喘肺組織中主要高表達在支氣管、微血管周圍的炎癥細胞及氣道上皮細胞中,因此ADAM8被認為可能通過調(diào)控炎癥細胞在氣道組織中的招募和遷移,參與到哮喘氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展中。盡管有關ADAM8基因敲除型哮喘小鼠的研究結(jié)果提示,ADAM8是一個潛在的哮喘治療藥物靶點,然而對于ADAM8在哮喘氣道炎癥

4、中究竟是促進了還是抑制了炎癥細胞的招募這一問題,學術界仍存有較大的爭議,且目前相關研究主要集中在動物模型層次,缺少一個細胞水平的系統(tǒng)性研究。另一方面,在這些炎癥細胞中,巨噬細胞具有參與宿主防御、吞噬細胞凋亡殘體和促進其他炎癥細胞在氣道中的早期招募等功能,在哮喘氣道炎癥中起到了至關重要的作用;前期研究提示ADAM8可能通過參與巨噬細胞與病原體的接觸從而影響了其活性、粘附能力、吞噬能力等生理功能,然而有關ADAM8對巨噬細胞生理功能的影響及

5、其潛在的力學調(diào)控機制,目前尚未見系統(tǒng)性的報道。這些問題的存在阻礙了我們對ADAM8參與哮喘氣道炎癥機制的理解,并制約了ADAM8作為藥物靶點用于哮喘治療的可能性。
　　因此,為了闡述清楚ADAM8的表達對于巨噬細胞生理功能的影響及其潛在的力學機制,進一步理解ADAM8在炎癥細胞遷移中所扮演的角色,并探索一個以ADAM8為藥物靶點的哮喘治療新方法,本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術調(diào)控了ADAM8在巨噬細胞中的表達,并檢測了ADAM8超表達或

6、沉默時,巨噬細胞在非激活狀態(tài)或免疫激活狀態(tài)(通過Lipopolysaccharide,即LPS誘導激活)下其活性、粘附、遷移、吞噬、凋亡等生物學行為以及硬度、收縮力、流變性質(zhì)等力學行為的變化,并在此基礎上驗證了一種針對ADAM8設計的特異性肽抑制劑在OVA致敏性小鼠哮喘模型中的治療作用。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1)調(diào)控ADAM8基因的表達改變了巨噬細胞遷移、粘附、增殖和吞噬的能力,但不影響巨噬細胞的內(nèi)源性凋亡過程。構(gòu)建ADA

7、M8基因超表達和干擾慢病毒重組載體,通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法將ADAM8在巨噬細胞中的基因和蛋白表達水平分別提高了2倍至3倍或下降了60％至70%。在此基礎上,通過MTT增殖實驗檢測發(fā)現(xiàn),無論給予或不給予LPS處理,提高ADAM8的表達均促進了巨噬細胞的活性及其增殖能力,其中在72h處分別提高約20%和40%(P<0.05);無論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達對巨噬細胞的活性均沒有影響。通過粘附實驗檢測發(fā)現(xiàn),提高ADAM8的表

8、達對經(jīng)LPS處理的巨噬細胞粘附于內(nèi)皮細胞的能力有促進作用,可提高約20%(P<0.05),而對未經(jīng)LPS處理的巨噬細胞的粘附能力沒有影響;無論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達均降低了巨噬細胞在內(nèi)皮細胞上的粘附,分別下降約30%和40%(P<0.05);通過劃痕實驗檢測發(fā)現(xiàn),無論給予或不給予LPS處理,提高ADAM8的表達均促進了巨噬細胞的側(cè)向遷移能力,分別提高約30%和20%(P<0.05);無論給予或不給予LPS處理,抑制

9、ADAM8的表達均降低了巨噬細胞的側(cè)向遷移能力,分別下降約40%(P<0.01)和30%(P<0.05)。通過Transwell實驗檢測發(fā)現(xiàn),無論給予或不給予LPS處理,提高ADAM8的表達均促進了巨噬細胞縱向遷移的能力,分別提高約30%(P<0.05)和40%(P<0.01);無論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達均降低了巨噬細胞的縱向遷移能力,分別下降約50%(P<0.05)和80%(P<0.01)。通過吞噬實驗檢測發(fā)現(xiàn),

10、無論給予或不給予LPS處理,提高ADAM8的表達對巨噬細胞吞噬細菌微粒的能力沒有顯著影響;無論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達均阻礙了巨噬細胞的吞噬能力,分別下降約40%和30%(P<0.05)。通過凋亡實驗檢測發(fā)現(xiàn),ADAM8的表達對于巨噬細胞內(nèi)源性凋亡的過程無明顯影響。
　　2)調(diào)控ADAM8基因的表達影響了巨噬細胞的細胞剛度和流變性質(zhì),但不影響其收縮力。通過光學磁微粒扭轉(zhuǎn)細胞測量技術檢測發(fā)現(xiàn),ADAM8表達的增高

11、對經(jīng)LPS處理的巨噬細胞的細胞剛度有提高作用,提高約40%(P<0.05),而對未經(jīng)LPS處理的巨噬細胞的細胞剛度沒有顯著影響;另外,無論給予或不給予LPS處理,抑制ADAM8的表達對巨噬細胞的細胞剛度均沒有顯著影響。另一方面,ADAM8表達的增高對經(jīng)LPS處理的巨噬細胞的細胞骨架響應外界刺激發(fā)生重塑的能力有提高作用,提高約20%(P<0.05),而對未經(jīng)LPS處理的巨噬細胞的流變性質(zhì)沒有顯著影響;無論給予或不給予LPS處理,抑制ADA

12、M8的表達對巨噬細胞的流變性質(zhì)沒有顯著影響。另外,無論給予或不給予LPS處理,ADAM8的表達對于巨噬細胞的收縮力沒有顯著影響。
　　3)ADAM8肽抑制劑BK-1361通過阻礙OVA致敏性哮喘小鼠氣道中嗜酸性粒細胞和Th2細胞因子介導的氣道炎癥有效緩解了其氣道高反應性及氣道重構(gòu)等哮喘癥狀。通過全身體積描記法檢測發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用降低了由乙酰膽堿誘導的哮喘小鼠氣道阻力(P<0.05),其中25μg/g和50μg/g小鼠體重

13、藥物濃度在50mg/mL乙酰膽堿濃度處可將氣道阻力降低約50%(P<0.05)。通過肺組織切片觀察發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用抑制了哮喘小鼠的氣道組織重構(gòu)的嚴重程度(P<0.05),其中25μg/g小鼠體重藥物濃度可將氣道組織病理評分降低約50%(P<0.05)。通過肺泡灌洗液中白細胞總數(shù)計數(shù)和分類計數(shù)檢測發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用阻礙了哮喘小鼠氣道中炎癥細胞、特別是嗜酸性粒細胞的浸潤和侵襲(P<0.05),其中25μg/g小鼠體重藥物可

14、將炎癥細胞和嗜酸性粒細胞計數(shù)分別降低約50%和60%(P<0.05)。通過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用降低了哮喘小鼠肺組織中Th2細胞因子的基因表達(P<0.05),其中25μg/g小鼠體重的藥物濃度對各種Th2細胞因子的整體控制效果較好。通過酶聯(lián)免疫吸附測定技術檢測發(fā)現(xiàn),BK-1361的使用可將哮喘小鼠肺勻漿中ADAM8催化剪切CD23的產(chǎn)物sCD23的含量降低約40%至50%(P<0.05),但不影響ADAM8自激活

15、的產(chǎn)物sADAM8的含量;總體而言,25μg/g小鼠體重的藥物濃度對OVA致敏性小鼠哮喘的控制效果最好。
　　上述研究結(jié)果表明1)ADAM8可能通過提高巨噬細胞的遷移能力及其粘附于內(nèi)皮的能力,促進哮喘氣道炎癥中巨噬細胞和其他炎癥細胞從血管系統(tǒng)到氣道組織的招募和遷移;2)ADAM8可能通過釋放相關炎癥因子和生長因子,激活哮喘氣道炎癥中巨噬細胞和其他炎癥細胞的炎癥響應,從而加速哮喘氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展;3)ADAM8可能通過直接影響巨

16、噬細胞的力學特性從而在巨噬細胞生理功能中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用;4)使用肽抑制劑BK-1361短暫抑制ADAM8在體內(nèi)的催化活性是一種相對安全的、效率較高的且具有較好療效的實驗性哮喘治療新方法。
　　以上研究結(jié)果一方面對于我們進一步認識和理解ADAM8在哮喘氣道炎癥中的作用,特別是其表達對巨噬細胞生理功能的影響及相關力學調(diào)控機制,并從細胞水平解釋不同研究結(jié)果中存在的矛盾具有重要的意義。另一方面本研究證實了ADAM8作為藥物靶點用于實驗