Ghrelin對放燒復(fù)合傷動物的救治作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、放射復(fù)合傷常見于核戰(zhàn)爭、核事故等事件中,對人員的生命構(gòu)成極大的威脅,尤其是放燒復(fù)合傷(combined radiation-burn injury, CRBI)。放燒復(fù)合傷是指同時或相繼受到以放射損傷為主,復(fù)合燒傷的一類復(fù)合傷,放燒復(fù)合傷傷情比單一傷更加復(fù)雜而難以控制。當(dāng)生物體遭受該類損傷后,其病理進(jìn)程主要經(jīng)歷以下幾個階段:休克和急性應(yīng)激,造血功能障礙,免疫抑制為主的免疫功能紊亂,感染,急性炎性反應(yīng),燒傷創(chuàng)面的延遲愈合或不愈合。其中,造

2、血功能障礙、免疫抑制和全身急性炎性反應(yīng)是導(dǎo)致死亡的重要原因。目前關(guān)于放燒復(fù)合傷的治療還主要停留在對癥治療而非對因治療階段,如輸血、骨髓移植、抗生素抗感染、血液凈化治療、植皮等。但這些治療都面臨著不同的問題,如代價高昂、副作用大、風(fēng)險高等。
　　本所前期研究顯示頸交感神經(jīng)阻滯(cervical sympathetic block, CSB)可顯著提高放燒復(fù)合傷動物的存活率,機(jī)制可能與降低了造血抑制程度,下調(diào)急性炎性反應(yīng)及促進(jìn)創(chuàng)面的愈

3、合等有關(guān)。CSB技術(shù)在臨床上已廣為使用,主要用于治療慢性疼痛,但由于某些原因使其受阻于臨床創(chuàng)傷或燒傷的治療。Ghrelin是一種內(nèi)源性腦腸肽,在哺乳動物中含28個氨基酸殘基,主要由胃底部X/A樣細(xì)胞分泌。Ghrelin還有多種生理作用,主要促進(jìn)生長激素(growth hormone, GH)分泌而調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝,還可調(diào)節(jié)免疫功能等。有研究顯示 Ghrelin還可主要通過影響植物神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性而對放射合并內(nèi)毒素?fù)p傷動物具有一定的救治作

4、用。首先其作用機(jī)制與CSB有類似之處(主要抑制交感神經(jīng)活性),其次Ghrelin在臨床相關(guān)疾病的治療中已體現(xiàn)出一定的治療效應(yīng),相較于CSB具有給藥更方便及毒副作用更小等優(yōu)點(diǎn),因此為了探究 Ghrelin是否對放燒復(fù)合傷動物也有一定救治作用并發(fā)展新型放燒復(fù)合傷治療藥物,著手了本研究。
　　本研究首先建立了放燒復(fù)合傷(重度)的致傷模型,該方法可概括為:動物接受5Gy劑量的γ射線照射,隨后在2小時內(nèi)利用溴鎢燈于動物背部進(jìn)行15％全身體表

5、面積(total body surface area, TBSA)的三度熱力燒傷。隨后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了如下幾個層次的研究:①與 CSB比較對放燒復(fù)合傷的救治效果。實(shí)驗(yàn)分組為“正常對照組,復(fù)合傷組,CSB治療組,Ghrelin治療組,CSB和Ghrelin的聯(lián)合治療組”,主要涉及到“外周血象、體重變化、創(chuàng)面愈合情況和存活率”4個方面的評價;②Ghrelin發(fā)揮救治作用的可能機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)分組為“正常對照組,正常并Ghrelin處理組,復(fù)合

6、傷組和Ghrelin治療組”,主要涉及到“造血、炎性反應(yīng)控制、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和器官保護(hù)”等方面的評價;③體外實(shí)驗(yàn)研究,主要研究對巨噬細(xì)胞、造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell, HSC)部分生物學(xué)功能的影響。在整個實(shí)驗(yàn)過程中:血象檢測主要觀察白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)在傷后某些時相點(diǎn)的改變情況;創(chuàng)面愈合情況及死亡率觀察持續(xù)時間為30天;促炎介質(zhì)TNF-α或 IL-6(存在于血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清中的)主要通過酶

7、聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)進(jìn)行檢測;神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)方面主要觀察血清中的各種神經(jīng)遞質(zhì)或激素的變化水平,如乙酰膽堿(acetyl choline,Ach)、兒茶酚胺和皮質(zhì)醇(cortisol, Cor)等;在器官保護(hù)作用研究方面主要采取蘇木素-伊紅染色( haematoxylin and eosin stain, H.E)、免疫組織化學(xué)(immunohistochemi

8、stry, IHC)的方法進(jìn)行評價;細(xì)胞水平上,嘗試建立了細(xì)胞的“放燒復(fù)合傷模型”,并檢測了 Ghrelin對巨噬細(xì)胞在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激下的存活率及其相關(guān)分泌功能的影響;同時又通過免疫磁珠分選的方法提取小鼠骨髓造血干細(xì)胞,探討了 Ghrelin對其增殖活性的影響。最終獲得的主要結(jié)果和結(jié)論整理歸納如下:
　　1. Ghrelin和 CSB均能顯著提高放燒復(fù)合傷動物的存活率約30%(與復(fù)合傷

9、組比較P<0.05)。但是兩者聯(lián)合治療的存活率與復(fù)合傷組比較并無顯著差異(P>0.05);血象方面,兩者對放燒復(fù)合傷動物的外周血象如 WBC和 PLT有相似的提升效果(在相應(yīng)時間點(diǎn)與復(fù)合傷組比較,P<0.05),主要是在傷后的第7天和第14天。但是兩者的聯(lián)合治療并未觀察到顯著的造血保護(hù)效果(與復(fù)合傷組比較P>0.05);最后在創(chuàng)面愈合和體重改變方面各組之間的差異也并不明顯。
　　2.在對植物神經(jīng)系統(tǒng)的影響研究中,考慮到下丘腦是Gh

10、relin的受體GHS-R1a分布的主要部位之一,這兩者的結(jié)合可影響植物神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性,因此檢測了下丘腦弓狀核內(nèi)GHS-R1a的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:與復(fù)合傷組比較,Ghrelin可顯著提高GHS-R1a在此區(qū)域的表達(dá)水平;另外通過測定應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)或激素的血清含量,發(fā)現(xiàn)Ghrelin可顯著降低復(fù)合傷動物血清中腎上腺素、5-羥色胺、乙酰膽堿和皮質(zhì)醇的分泌水平(與復(fù)合傷組比較,P<0.05)。說明 Ghrelin可調(diào)節(jié)植物神經(jīng)系統(tǒng)的興奮

11、性(主要抑制交感神經(jīng))和抑制HPA軸的過度激活。
　　3. Ghrelin可降低復(fù)合傷動物血清中炎性介質(zhì)如TNF-α和IL-6的分泌(與復(fù)合傷組比較,P<0.05);另體外研究也發(fā)現(xiàn),Ghrelin雖對LPS處理下巨噬細(xì)胞的存活率和NO、NOS(NO合成酶)的分泌無顯著影響(與LPS處理組比較, P>0.05),但可明顯抑制巨噬細(xì)胞炎性介質(zhì)TNF-α的分泌(與LPS處理組比較P<0.05)。說明Ghrelin對放燒復(fù)合傷所致的急性

12、炎性反應(yīng)也有一定的調(diào)控作用。
　　4. Ghrelin可顯著提高放燒復(fù)合傷動物傷后第10天骨髓中的有核細(xì)胞計(jì)數(shù)(與復(fù)合傷組比較,P<0.05);再通過相關(guān)組織病理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)Ghrelin防止了復(fù)合傷動物骨髓中造血細(xì)胞的急劇減少;但體外研究證實(shí)Ghrelin對HSC的增殖功能并無顯著影響,因此其造血保護(hù)作用有可能是通過其他途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　綜上,通過建立放燒復(fù)合傷模型,比較Ghrelin與CSB對放燒復(fù)合傷的救治效果及后續(xù)的