α酮戊二酸對酒精性肝病的干預(yù)作用及其相關(guān)機制研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 酒精性肝病(ALD)是由于長期大量飲酒所致的慢性肝臟疾病，在歐美國家發(fā)病率較高，近年來，隨著我國居民生活水平的提高，生活方式的改變，嗜酒者增多，ALD的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，酒精已經(jīng)成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損傷的第二大病因。ALD可分為輕型酒精性肝病、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化5種類型，研究發(fā)現(xiàn)有15％的肝硬化患者最終會發(fā)展為肝癌。
　　 盡管ALD的發(fā)病機制十分復(fù)雜

2、，涉及乙醇及其代謝產(chǎn)物的毒性、免疫因素、炎癥反應(yīng)、鐵超負(fù)荷、細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激反應(yīng)等，但以氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化為中心的“二次打擊”假說比較能夠解釋ALD的全過程。急慢性酒精攝入均能增加活性氧如O2-、H2O2的產(chǎn)生，減少抗氧化物水平，增強氧化應(yīng)激反應(yīng)。最近研究表明，氧化應(yīng)激可能通過參與線粒體損傷、脂質(zhì)代謝障礙、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等引起各階段ALD的發(fā)生。乙醇主要經(jīng)胞液中的乙醇脫氫酶(ADH)及微粒體中細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1

3、)途徑代謝，并均可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生。CYP2E1的激活是酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的重要途徑，為酒精性肝病的主要發(fā)病機制。
　　 α-酮戊二酸(α-KG)是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物之一，常作為運動營養(yǎng)飲料的成分。研究發(fā)現(xiàn)α-KG可增加細(xì)胞活性、降低體外細(xì)胞培養(yǎng)體系及機體產(chǎn)生的活性氧含量，具有明顯的抗氧化作用；同時還可減輕急慢性氰化物中毒誘導(dǎo)的大腦氧化應(yīng)激狀態(tài)，起到明顯的細(xì)胞保護作用；改善鋁脅迫下引起的線粒體功能障礙并減輕缺氧誘導(dǎo)

4、因子1a在細(xì)胞核內(nèi)的聚集，恢復(fù)a-酮戊二酸脫氫酶(KGDH)、琥珀酸脫氫酶(SDH)及脯氨酸羥化酶2(PHD2)的活性及表達(dá)；上調(diào)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)，增加胰島素、生長激素及胰島素樣生長因子Ⅰ(IGFI)等的血清水平；減輕實驗動物內(nèi)毒素血癥誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及胃腸粘膜損傷，并改善胃腸黏膜完整性及營養(yǎng)吸收。但α-KG對酒精誘導(dǎo)的肝損傷的干預(yù)作用的相關(guān)研究卻很少。本研究旨在通過體外實驗的方法，探討α-KG對酒精性肝病的干預(yù)作用及可能涉及的機制。

5、r>　　 方法：
　　 (1)實驗分組：培養(yǎng)人永生化正常肝細(xì)胞株HL7702細(xì)胞1天，貼壁后分為4組：對照組常規(guī)培養(yǎng)10天；酒精模型組：用酒精誘導(dǎo)8天后換正常培養(yǎng)液培養(yǎng)2天；酒精加α-KG組：同時用酒精和α-KG干預(yù)8天后換正常培養(yǎng)液培養(yǎng)2天；α-KG組：加入α-KG干預(yù)8天后換正常培養(yǎng)液培養(yǎng)2天。各組細(xì)胞均以3天為周期傳代，每天換液。實驗重復(fù)3次。
　　 (2)氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：模型建立后油紅O染色倒置顯微鏡觀察各組

6、細(xì)胞模型脂滴變化情況；熒光顯微鏡觀察各組ROS熒光著色情況并用流式細(xì)胞儀檢測各組ROS相對含量；檢測各組MDA含量、SOD及CAT活性變化；流式細(xì)胞儀檢測各組凋亡情況；WesternBlot檢測各組酒精代謝酶ADH、CYP2E1表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)模型建立：成功建立酒精性脂肪變HL7702細(xì)胞模型，油紅O染色結(jié)果顯示酒精模型組較對照組、酒精+α-KG組及α-KG組脂滴含量多且脂滴大；
　　 (2

7、)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)：與對照組比較，酒精模型組細(xì)胞凋亡率升高、MDA及ROS含量增加、ROS熒光著色強，SOD及CAT活性降低；與酒精模型組比較，酒精+α-KG組及α-KG組細(xì)胞凋亡率、MDA及ROS含量降低，ROS熒光著色暗，SOD及CAT活性升高；
　　 (3)乙醇代謝酶：與對照組比較，酒精模型組ADH及CYP2E1表達(dá)增加；與酒精模型組比較，酒精+α-KG組及α-KG組ADH及CYP2E1表達(dá)降低。
　　 結(jié)論：