大棗葛根對(duì)酒精性肝病的防治作用和分子機(jī)制探索.pdf

1、目的：酒精性肝病是長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟損害。酒精性肝病早期僅表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展成酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和酒精性肝硬化，該病是我國(guó)繼病毒性肝炎之后的第二大肝病。
　　研究顯示CYP2E1、TNF-α和SIRT1參與機(jī)體的代謝途徑、炎癥和氧化應(yīng)激、能量感受三個(gè)不同的途徑。已經(jīng)證實(shí)CYP2E1在長(zhǎng)期大量飲酒時(shí)可以誘導(dǎo)其代謝活性增加，一方面加速對(duì)酒精的清除，另一方面產(chǎn)生大量的活性氧對(duì)肝臟產(chǎn)生損害。在動(dòng)物模型和嗜酒的人群中均檢測(cè)

2、到TNF-α血清水平增加，其參與了膠原纖維的沉積和肝硬化，是酒精性肝硬化分子基礎(chǔ)。SIRT1與肝細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)，是一個(gè)“能量感受”分子，能感受機(jī)體和細(xì)胞的能量代謝。其表達(dá)量與NAD+/NADH和乳酸/丙酮酸的比值變化密切相關(guān)，當(dāng)二者比值升高時(shí)，SIRT1表達(dá)增加，反之亦然。SIRT1在酒精性肝病中發(fā)生什么變化呢?
　　大棗中含有黃酮類(lèi)化合物，應(yīng)用大棗的醇提物可以明顯增加內(nèi)源性抗氧化酶的活力和肝組織中谷胱甘肽的量，研究表明大棗

3、具有保肝作用，能明顯減輕肝臟的氧化和硝基化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，減輕肝損傷。葛根為傳統(tǒng)中藥，其所含的黃酮具有抗氧化、解酒毒作用。實(shí)驗(yàn)顯示葛根黃酮可見(jiàn)減少乙醇導(dǎo)致的腸粘膜通透性增加，可以減輕酒精導(dǎo)致的肝脂肪變。
　　本實(shí)驗(yàn)是為了觀察大棗和葛根對(duì)酒精性肝病的防治作用，并與保肝藥物聯(lián)苯雙酯作比較，從病理變化驗(yàn)證它們的抗酒精性肝損傷的效果，并探討用藥后對(duì)酒精性肝損傷CYP2E1、TNF-α和SIRT1三種分子變化的影響。
　　方法：

4、>　　1.1動(dòng)物分組
　　2-3周齡的雄性昆明種清潔級(jí)小鼠114只，隨機(jī)將其分為兩組，對(duì)照組24只，模型組90只。模型組隔日灌胃酒精飲料8ml/kg，灌胃4周后，對(duì)照和模型組各隨機(jī)取8只處死取材，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)變化；模型組再次按體重隨機(jī)分為4組，各組均隔日灌胃酒精飲料8ml/kg。大棗組20只，灌酒之前4小時(shí)灌胃大棗提取物0.02g/kg，葛根組20只，灌酒之前4小時(shí)灌胃葛根提取物0.01g/kg，聯(lián)苯雙酯組20只，灌酒之前4小時(shí)灌

5、胃聯(lián)苯雙酯7.5mg/kg，病理組22只，灌酒之前4小時(shí)灌胃等量蒸餾水。灌胃8周末和12周末分批處死小鼠取材。
　　1.2標(biāo)本的獲取
　　小鼠股靜脈采血后，頸椎脫臼處死，處死前禁食12h。處死后立即取出肝臟，稱(chēng)重后取左外側(cè)葉4％的多聚甲醛固定，另外一部分標(biāo)本分裝在EP管內(nèi)，-80℃凍存。血標(biāo)本用于測(cè)定生化指標(biāo)。
　　1.3 CYP2E1、SIRT1蛋白表達(dá)的測(cè)定
　　提取肝臟總蛋白，Lowry法測(cè)蛋白含量，以β-

6、actin為內(nèi)參照，用Western-blotting法檢測(cè)各組CYP2E1、SIRT1的相對(duì)表達(dá)量。
　　1.4 TNF-α和ALT、AST的測(cè)定
　　提取肝臟總蛋白，Lowry法測(cè)蛋白含量，用ELISA試劑盒測(cè)定肝組織中TNF-α的相對(duì)表達(dá)水平。抽取小鼠靜脈血，分離上層血清，用轉(zhuǎn)氨酶試劑盒測(cè)定血清中ALT、AST表達(dá)水平。
　　1.5數(shù)據(jù)處理
　　所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)間的比較，應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，

7、所有的數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±S)表示，多組間均值的比較用單因素的方差分析。經(jīng)檢驗(yàn)各組方差齊，進(jìn)一步比較選用LSD多重比較檢驗(yàn)，α=0.05或者0.01。經(jīng)檢驗(yàn)方差不齊，進(jìn)一步組間比較選用DunnettT3多重檢驗(yàn)，α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1一般情況
　　含乙醇液體灌胃初期小鼠出現(xiàn)嗜睡，食欲較差，進(jìn)食減少，反應(yīng)遲鈍，短時(shí)間共濟(jì)失調(diào)，易激惹，皮毛光澤差等，約4周上述癥狀逐漸改善，對(duì)照組無(wú)上述改變。
　　

8、2體重
　　4周、8周各組體重相比結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。12周時(shí)，對(duì)照組小鼠體重與病理組、大棗組、葛根組、聯(lián)苯雙酯組相比較重，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3肝臟的組織病理學(xué)改變
　　對(duì)照組臟染色標(biāo)本見(jiàn)肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉輪廓清晰，肝索排列整齊。細(xì)胞內(nèi)脂肪滴少見(jiàn)，Masson染色未見(jiàn)纖維形成。造模組4周時(shí)可見(jiàn)輕度脂肪變性，肝細(xì)胞濁腫，胞漿中出現(xiàn)大小不等的脂滴；8周時(shí)，細(xì)胞索

9、紊亂，胞漿腫大疏松化，其內(nèi)細(xì)胞核固縮，可見(jiàn)肝細(xì)胞廣泛性的空泡樣變性，脂肪變性較4周模型組小鼠增多；12周時(shí)，肝細(xì)胞點(diǎn)狀及灶狀壞死較多見(jiàn)，匯管區(qū)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，一些壞死區(qū)可見(jiàn)明顯充血及空泡樣變性；16周時(shí)，炎癥壞死和炎細(xì)胞侵潤(rùn)更加明顯，匯管區(qū)無(wú)明顯膠原纖維增生。各個(gè)治療組也出現(xiàn)不同程度的病理變化，但病變的程度明顯較輕，細(xì)胞內(nèi)脂肪變較少。
　　4血清AST和ALT
　　4.1 AST
　　4周時(shí)，對(duì)照組與病理組血清AST結(jié)

10、果相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。8周時(shí)，病理組血清AST水平與對(duì)照組及各治療組相比明顯增高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。12周時(shí)，病理組血清AST水平與其余各組相比仍然較高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　4.2 ALT
　　4周時(shí)，病理組血清ALT水平與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。8周時(shí)，病理組血清ALT水平與其余各組相比明顯增高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。12周時(shí)，病理組血清A

11、LT水平與其余各組相比明顯增高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；聯(lián)苯雙酯組血清ALT水平和對(duì)照組，各治療組之間血清ALT水平相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　5肝組織TNF-α的水平
　　4周時(shí)，病理組TNF-α的水平與對(duì)照組相比顯著增高(P<0.05)。8周時(shí)，病理組TNF-α水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)、葛根組和聯(lián)苯雙酯組(P<0.05)，但是與大棗組無(wú)差異；12周時(shí)，病理組TNF-α水平顯著高于與對(duì)照組

12、(P<0.01)、葛根組(P<0.05)；但與大棗組和聯(lián)苯雙酯組無(wú)差異。
　　6肝組織蛋白表達(dá)
　　6.1 SIRT1
　　4周時(shí)，病理組SIRT1的水平與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.01)。8周時(shí)，病理組SIRT1的水平顯著高于與對(duì)照組和聯(lián)苯雙酯組，而低于葛根組，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，聯(lián)苯雙酯組SIRT1蛋白水平與葛根組、大棗組和病理組相比明顯較低(P<0.01)，而與對(duì)照組相比結(jié)果無(wú)差異(P>0.0

13、5)；12周時(shí)，病理組與對(duì)照組和聯(lián)苯雙脂組相比結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，病理組與大棗組和葛根組相比結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　6.2 CYP2E1
　　4周時(shí)，病理組CYP2E1蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比明顯增高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。8周時(shí)，病理組與其余各組相比，CYP2E1蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯增多，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，大棗組和葛根組及聯(lián)苯雙酯組相比結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>

14、0.05)；而葛根組CYP2E1水平高于聯(lián)苯雙酯組(P<0.05)。12周時(shí)，病理組CYP2E1蛋白的水平和其余各組相比明顯增高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)：大棗組與葛根組和聯(lián)苯雙酯相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；葛根組CYP2E1蛋白水平和聯(lián)苯雙酯組相比依然較高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　在小鼠酒精性肝病的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，隨著飲酒時(shí)間的增加，肝組織出現(xiàn)病理?yè)p傷，肝組織中SIRT1、CY