煙酰胺核糖對非酒精性脂肪性肝病的治療作用及機制.pdf

1、目的：
　　非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一類疾病譜的總稱，包括非酒精性單純性脂肪變(simple steatosis，SS)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，即在SS的基礎(chǔ)上出現(xiàn)肝臟炎癥浸潤和或纖維化，NAFLD進一步可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。隨著肥胖及其相關(guān)代謝綜合征全球化的流行，NAFLD現(xiàn)已成為

2、西方發(fā)達國家慢性肝病最常見的原因，成人NAFLD的患病率為10％～30％，并且老年人群的NAFLD發(fā)病率更高。NAFLD已成為我國除病毒性肝炎外，引起肝功能酶學(xué)異常和慢性肝病最常見的原因。然而，目前針對NAFLD尚無有效的藥物治療方法。
　　煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）是由脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪因子，具有細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外活性。細(xì)胞內(nèi)NAMPT是哺乳動

3、物體內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)補救合成途徑的限速酶，NAD作為生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的輔酶在細(xì)胞基礎(chǔ)生命活動中發(fā)揮著重要的生理功能。
　　既往研究表明，NAMPT-NAD信號通路參與調(diào)控肥胖、胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)以及抗衰老等病理生理活動，而這些生物學(xué)功能又與NAFLD密切相關(guān)。因此，我們提出猜想，NAMPT-NAD信號通路是否參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展

4、？于是，我們構(gòu)建了NAMPT酶失活突變體的轉(zhuǎn)基因(Dominant-Negative NAMPT transgenic)小鼠（DN-NAMPT小鼠的內(nèi)源性NAMPT表達和活性受到抑制）。探討NAMPT-NAD信號通路與NAFLD之間的關(guān)系并證實肝臟NAMPT水平下降能促進NAFLD的進展，在此實驗的基礎(chǔ)上，本課題進一步研究補充NAD的前體煙酰胺核糖(Nicotinamide Riboside，NR)治療能否改善或逆轉(zhuǎn)NAFLD的進展以及

5、老年化相關(guān)的NAD下降與NAFLD的關(guān)系。
　　方法:
　　1，將10周左右小鼠分為WT組、DN-NAMPT組和DN-NAMPT+NR治療一個月組，觀察小鼠在正常飲食下肝臟損傷情況（血清AST、ALT）、和血脂水平，測定肝臟的TG、TC和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物(MDA)水平，并且檢測與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的mRNA表達變化，使用F4/80及TNF-α免疫組織化學(xué)染色觀察肝臟巨噬細(xì)胞浸潤和炎癥因子表達情況，同時測定小鼠的體重和肝重。

6、　　2，將10周左右的普通C57BL/6小鼠分為正常飲食組（Chow組）、高脂飲食組（HFD組）和HFD+NR組，HFD組小鼠高脂飼料（脂肪供能比為45％的NAFLD模型高脂飼料）喂養(yǎng)12周，而HFD+NR組高脂飼料喂養(yǎng)3個月，第3個月同時補充煙酰胺核糖治療。對比三組小鼠的體重、肝重以及肝臟TG和TC含量，并檢測肝臟炎癥因子（TNF-α和IL-1β）的基因轉(zhuǎn)錄，肝臟油紅O染色觀察脂質(zhì)沉積，同時使用α-SMA免疫組化和Masson染色判斷

7、小鼠的肝臟纖維化程度。
　　3，使用Western blotting的方法檢測Adult組（4個月）、Middle-aged組(12個月)和Old組（20個月）C57BL/6小鼠，以及行肝臟切除術(shù)的中年(Age＜45歲)和老年（Age＞60歲）患者的非病變肝臟組織NAD的含量以及NAD合成途徑中關(guān)鍵酶NAMPT、IDO、NADS和NMNAT的表達，另外，使用免疫組化的方法對比中年和老年患者的肝臟NAD合成途徑中關(guān)鍵酶的含量。

8、>　　結(jié)果:
　　1，正常飲食下，DN-NAMPT小鼠的體重、肝重以及血清TG和TC水平與WT組無明顯差別，但肝臟TG、TC和氧化應(yīng)激產(chǎn)物(MDA)水平，巨噬細(xì)胞浸潤以及炎癥因子表達明顯高于WT組，而甘油三酯和膽固醇轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因mRNA水平明顯較WT組低。補充NAD前體NR治療后肝臟TG、TC和MDA水平以及炎癥因子表達明顯降低，巨噬細(xì)胞浸潤程度改善，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達上調(diào)。補充NR能夠改善DN-NAMPT小鼠輕微脂肪變、肝臟

9、炎癥浸潤和氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　2，補充NAD前體NR治療能夠降低NAFLD小鼠的體重、肝重和肝指數(shù)，以及肝臟TG、TC的含量，油紅O染色顯示補充NR治療NAFLD小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積程度顯著下降，并且炎癥因子（TNF-α和IL-1β）在肝臟的表達也降低，免疫組化的結(jié)果顯示病程NR治療還能改善NAFLD小鼠的肝纖維化程度。
　　3，年齡與肝臟NAD含量呈負(fù)相關(guān)。Western blotting結(jié)果顯示老年組小鼠及老年組患者的肝臟

10、NAMPT和NAD水平顯著下降，而NAD從頭合成途徑的關(guān)鍵酶（IDO、NADS和NMNAT）蛋白質(zhì)水平明顯增加，并且，免疫組化的結(jié)果也證實老年患者的肝臟NAMPT下調(diào)，但IDO、NADS和NMNAT表達增加。
　　結(jié)論:
　　1，補充NAD前體NR能夠逆轉(zhuǎn)NAMPT下降導(dǎo)致的小鼠肝臟脂肪變。
　　2，補充NAD前體NR能夠延緩或部分逆轉(zhuǎn)HFD導(dǎo)致的小鼠NAFLD病變，補充NR治療可能作為老年NAFLD患者的一個潛在治療