肝X受體對3T3-L1前脂肪細胞成熟過程中11β-羥化類固醇脫氫酶1mRNA表達的影響.pdf

1、研究背景:
　　 肥胖癥是由機體在遺傳、環(huán)境因素及其兩者相互作用下引起的一種慢性代謝性疾病，其病因和發(fā)病機制目前仍不清楚。由肥胖引起的以胰島素抵抗為核心的代謝綜合征及其心血管嚴重并發(fā)癥已嚴重地影響人們的生命健康，同時也給社會帶來了沉重的經濟負擔。肥胖的發(fā)生主要是由脂肪細胞的過度分化和脂質堆積引起，所以從根本上講，治療肥胖就是抑制脂肪細胞的過度分化和脂質的堆積，從而預防糖尿病、冠心病等相關疾病的發(fā)生。因此，有關脂肪細胞分化調控的機

2、制成為近年來研究的熱點。v肝X受體(Liver X Receptors,LXRs)是一種氧化固醇激活的核受體，有LXRα和LXRβ兩種亞型。它們調控著膽固醇代謝、吸收、轉運過程中一些關鍵基因的表達，是膽固醇代謝的傳感器。在腸道，激活LXRs可以通過ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding Cassette Transporter A1，ABCA1)減少膽固醇的吸收；在巨噬細胞中激活LXRs可以調節(jié)許多參與脂肪代謝的基因如載脂蛋白

3、E(Apolipoprotein E，ApoE)等的表達，調節(jié)膽固醇的逆向轉運；在肝臟，LXRs調節(jié)膽固醇7α-羥化酶(Cholesterol 7 α-hydroxylase,CYP7A1)的表達，而該酶是膽固醇轉化成脂肪酸的限速酶；LXRs在膽固醇轉換成膽汁酸的過程中起著中樞的作用。盡管LXRs在脂肪組織中有穩(wěn)定性表達，科學家也證實了LXRs對成熟脂肪細胞代謝的許多基因具有重要的調節(jié)作用，然而LXRs對脂肪分化成熟的影響及其機制仍然不

4、清楚。例如Ross等人指出LXRs對脂肪的分化沒有起促進作用，甚至是起到脂解作用；Hummasti認為LXRs的激活沒有對脂肪的形成和堆積產生影響。Seo則認為LXRα能夠促進前脂肪細胞的分化。所以LXRs對脂肪細胞分化的影響還有待今后研究證實。
　　 11β-羥化類固醇脫氫酶1(11-Hydroxysteroid Dehydrogenase-1，11 β-HSD1)屬于短鏈脫氫/還原酶蛋白超家族，是一種微粒體酶，廣泛分布于肝臟

5、、腎臟、脾臟、垂體、脂肪等器官和組織中。在人體內，該酶主要將無活性的可的松轉變?yōu)橛谢钚缘臍浠傻乃桑瑥亩{節(jié)局部器官活性的可的松水平，調節(jié)糖皮質激素的生理作用。對轉基因動物模型研究表明，11β-HSD1在脂肪組織中過度表達，可產生類似于代謝綜合征的表型。對11β-HSD1基因敲除小鼠模型的研究發(fā)現該小鼠糖耐量升高，胰島素敏感性升高，血糖下降，其代謝綜合征的癥狀可被逆轉。所以選擇性的11β-HSD1抑制劑有望成為治療肥胖、高血壓等代謝性疾

6、病的靶點。
　　 11β-HSD1在脂肪細胞分化過程中起到重要的作用，通過沉默11β-HSD1基因的表達可以抑制脂肪細胞的分化，而LXRs激動劑T0901317能夠在成熟的脂肪細胞中下調11β-HSD1的表達，那么LXRs是否通過調控前脂肪細胞11β-HSD1的表達而影響脂肪細胞的分化，有待進一步的研究證實。
　　 研究目的:
　　 研究LXRs激動劑T0901317對3T3-L1前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞過

7、程的影響，以及在脂肪細胞分化成熟過程中它對11β-HSD1、糖皮質受體(glucocorticoid receptor，GR)、鹽皮質激素(mineralocorticoid receptor，MR)mRNA表達的影響。
　　 材料和方法:
　　 1.3T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)、誘導分化及鑒定。
　　 在37℃、5％CO2的環(huán)境下，用含10％胎牛血清(Fetal bovineserum，FBS)的高糖(25mmo

8、l/L)DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞。每2天更換新鮮的完全培養(yǎng)液，約3-4天細胞達到生長抑制狀態(tài)。當細胞達到生長抑制狀態(tài)兩天后，換用含0.5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、1.7μmol/L胰島素、1μmol/L地塞米松和10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液兩天，然后換用含1.7μmol/L胰島素和10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)兩天，隨后換用

9、完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的分化情況，約8-10天后細胞分化成熟。此時可以行油紅O染色進行鑒定。
　　 2.實驗分組及技術路線。
　　 將3T3-L1前脂肪細胞設為2組：對照組和實驗組。實驗組在細胞融合后1天(即誘導前24 h)加入溶解于終濃度為0.01％的二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)的LXRs激動劑T0901317 2 μmol/L，持續(xù)刺激至分化成熟；對照組則在相同的時間

10、加入終濃度為0.01％的DMSO，同樣持續(xù)至分化成熟，期間分別觀察0天、4天、8天細胞的分化情況，并收集細胞用于檢測11 β-HSD1、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase，LPL)、GR、MR的mRNA的表達情況，初步了解兩組脂肪細胞分化情況與11 β-HSD1、GR、MR mRNA表達情況之間的關系。
　　 3.實驗方法：
　　 (1)：培養(yǎng)及誘導3T3-L1細胞。
　　 (2)：油紅染色觀察細

11、胞分化情況。
　　 (3)：用Real-time PCR檢測相關指標的mRNA表達。
　　 4.統(tǒng)計學分析：
　　 實驗所得數據用均數±標準差表示，用SPSS13.0進行統(tǒng)計處理，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；以P＜0.05判定差異有統(tǒng)計學意義.
　　 結果:
　　 1.3T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)、誘導分化及鑒定。
　　 3T3-L1前脂肪細胞呈貼壁生長，3-4天長至瓶底7

12、0％-80％，呈梭形或多角型，細胞核居中。誘導分化第8天開始，細胞變成圓形，細胞核偏于細胞一側，細胞漿中可見折光性強的脂滴聚集，油紅0染色鑒定可見成熟脂肪細胞胞漿內的脂滴被染成紅色。
　　 2.在3T3-L1前脂肪細胞誘導分化過程中，實驗組在第4天與對照組相比，明顯促進脂肪細胞內脂滴生成；而在第8天與對照組相比，兩組之間則沒有明顯的差異。
　　 3.在3T3-L1細胞分化過程中標志細胞分化情況基因LPL mRNA表達水平

13、。
　　 (1)第4天高于第0天(2.71±1.05，vs.1±0，P＜0.01)。
　　 (2)第8天高于第4天(23.46±6.64，vs.2.71±1.05，P＜0.01)。
　　 4.兩組3T3-L1細胞在分化過程中標志細胞分化情況基因LPL mRNA水平的比較。
　　 (1)第4天：實驗組高于對照組(6.70±3.07，vs.2.71±1.05，P＜0.05)。
　　 (2)第八天：實驗

14、組和對照組間差別無統(tǒng)計學意義(18.81±7.22，vs.23.46±6.64，P＞0.05)。
　　 5.兩組3T3-L1細胞在分化過程中11β-HSD1m RNA水平的比較。
　　 (1)第四天：實驗組和對照組間差別無統(tǒng)計學意義(24.75+11.62，vs.29.75+14.60，P＞0.05)。
　　 (2)第八天：實驗組低于對照組(158.77+13.43，vs.479.07+243.85,P＜0.05

15、)。
　　 6.兩組3T3-L1細胞在分化過程中GR mRNA水平的比較。
　　 (1)第四天：實驗組和對照組間差別無統(tǒng)計學意義(1.12+0.63，vs.1.23+0.65,P＞0.05)。
　　 (2)第八天：實驗組和對照組間差別無統(tǒng)計學意義(1.64+1.07，vs.1.97+1.47，P＞0.05)。
　　 7.兩組3T3-L1細胞在分化過程中MR mRNA水平的比較(1)第四天：實驗組和對照組間

16、差別無統(tǒng)計學意義(0.70+0.11，vs.0.75+0.35)。
　　 (2)第八天：實驗組高于對照組(1.52+0.21，vs.0.96+0.28，P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.LXRs激動劑T0901317很可能對3T3-L1前脂肪細胞分化存在影響；
　　 2.LXRs激動劑T0901317在3T3-L1前脂肪細胞分化后期可以下調11β-HSD1的mRNA表達；
　　 3.LXR