C-IAP2在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中表達(dá)的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 肝細(xì)胞肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是世界成人最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約有650，000患者罹患此病，如今肝癌已成為世界第三大癌癥殺手。盡管有關(guān)肝癌的生物學(xué)特性以及發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究較多，診斷技術(shù)的顯著進(jìn)步以及外科治療水平的提高，肝癌患者的預(yù)后仍然不太理想，外科手術(shù)切除后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)65％以上。因此，探索評(píng)估HCC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移傾向的分子機(jī)制，對(duì)HCC的病程進(jìn)展、預(yù)后評(píng)估

2、有重要意義。近年來，多項(xiàng)研究表明，細(xì)胞凋亡抑制蛋白C-IAP2(cellular inhibitor of apoptotic protein-2)作為IAPs( inhibitor of apoptotic proteins)家族重要成員之一，廣泛高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。
　　 本研究采用熒光定量PCR、免疫熒光技術(shù)和Western Blot檢測(cè)三種不同侵襲潛能的肝癌細(xì)胞株中C-IAP2

3、mRNA和蛋白的表達(dá)情況，分析肝癌細(xì)胞株中C-IAP2mRNA和蛋白的表達(dá)同肝癌侵襲潛能的關(guān)系，并通過熒光定量PCR、免疫組化等技術(shù)檢測(cè)原發(fā)性肝癌患者肝癌組織，癌邊緣組織及非癌組織中C-IAP2mRNA和蛋白的表達(dá)情況，探討C-IAP2mRNA和蛋白的表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系，從組織水平分析C-IAP2的表達(dá)與HCC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，為HCC的臨床診斷、病程進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估提供新的線索。
　　 方法:
　　 1

4、、運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)具有不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721、HCCLM3中C-IAP2mRNA的表達(dá);并運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和Western Blot檢測(cè)上述三種細(xì)胞株C-IAP2蛋白的表達(dá)情況。分析C-IAP2的表達(dá)同肝癌細(xì)胞侵襲潛能之間的關(guān)系。
　　 2、收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科2010年11月～2012年1月接受手術(shù)治療的原發(fā)性肝癌患者的組織標(biāo)本，標(biāo)本均在離體2小時(shí)內(nèi)取材固定，術(shù)后均經(jīng)病理

5、證實(shí)。
　　 3、運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)72例肝癌患者的癌組織與非癌組織中C-IAP2mRNA的表達(dá)，以了解C-IAP2mRNA在肝癌組織與非癌組織的表達(dá)差異;并分析肝癌組織中C-IAP2mRNA的表達(dá)和臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　 4、運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)75例肝癌患者的癌組織、癌邊緣組織以及對(duì)應(yīng)的非癌組織中的C-IAP2蛋白的表達(dá)，以了解C-IAP2蛋白在癌組織、癌邊緣組織及對(duì)應(yīng)的非癌組織的表達(dá)差異，進(jìn)一步分析癌組

6、織中的C-IAP2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理， C-IAP2在肝癌組織、癌邊緣組織和非癌組織中蛋白陽性表達(dá)率的比較以及不同臨床病理特征情況下C-IAP2在肝癌組織中的陽性表達(dá)率的比較均采用Pearson Chi-Square檢驗(yàn)。肝癌組織中C-IAP2mRNA和蛋白不同表達(dá)強(qiáng)度的復(fù)發(fā)的比較采用生存分析（Kaplan-Meier曲線，log-rank法）。

7、熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△CT進(jìn)行處理，每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各樣本平均CT(threshold cyclenumber)值和△CT值(△CT＝CT C-IAP2-CTGAPDH)，計(jì)算2-△△ct（CT＝CT目的-CT對(duì)照），其數(shù)值表示目的表達(dá)值相對(duì)于對(duì)照表達(dá)值的相對(duì)倍數(shù)，計(jì)量資料以X+SD表示。癌組織與對(duì)應(yīng)非癌組織間C-IAP2 mRNA的表達(dá)的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，C-IAP2mRNA的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的

8、比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、方差分析、LSD-t檢驗(yàn)，三種不同侵襲潛能肝癌細(xì)胞株C-IAP2 mRNA和蛋白的比較均采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，采用雙側(cè)性檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1、熒光定量PCR結(jié)果顯示C-IAP2mRNA在三種不同侵襲潛能細(xì)胞株中均有表達(dá)，侵襲轉(zhuǎn)移潛能最強(qiáng)的HCCLM3表達(dá)最高，SMMC7721次之，無侵襲轉(zhuǎn)移潛能的HepG2表達(dá)最低，HCCLM3的表達(dá)量為HepG2的54.

9、95倍，SMMC7721的表達(dá)量為HepG2的12.13倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、Western Blot檢測(cè)三種不同侵襲潛能肝癌細(xì)胞株C-IAP2蛋白的表達(dá)水平，侵襲轉(zhuǎn)移潛能最強(qiáng)的HCCLM3表達(dá)最高（9.109+0.632），SMMC7721次之（2.689+0.637），無侵襲轉(zhuǎn)移潛能的HepG2表達(dá)最低（0.297+0.556），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝348.001;P＜0.001）。
　　

10、 3、細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示每種細(xì)胞株胞漿和胞核內(nèi)都可見不同程度陽性染色，C-IAP2在高侵襲潛能細(xì)胞株HCCLM3的胞漿和胞核均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而C-IAP2在HepG2、SMMC7721胞核和胞漿中均呈弱陽性表達(dá)，C-IAP2在三種細(xì)胞株中的表達(dá)情況為:HCCLM3＞ SMMC7721＞HepG2。
　　 4、72例肝癌患者肝癌組織中C-IAP2mRNA的表達(dá)量較對(duì)應(yīng)的非癌組織明顯升高，癌組織中的表達(dá)量為非癌組織的2.70倍，

11、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 5、 C-IAP2mRNA在肝癌組織中的表達(dá)與患者術(shù)前有無癌栓、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、AFP水平、腫瘤病理分化類型、TNM分期以及預(yù)后有關(guān)(P＜0.05)，術(shù)前有癌栓的C-IAP2mRNA表達(dá)量為無癌栓的9.65倍，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的6.53倍，AFP＞400ug/L的為AFP＜400ug/L的2.79倍，TNM分期中Ⅲ-Ⅳ期的表達(dá)量為Ⅰ-Ⅱ期的6.63倍，病理分化類型經(jīng)方差分析

12、和LSD-t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)中分化和低分化者均較高分化者表達(dá)量高，而中、低分化之間無差異，C-IAP2mRNA高表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)率比低表達(dá)組術(shù)后復(fù)發(fā)率高。C-IAP2mRNA在肝癌組織中的表達(dá)與患者性別、年齡、乙型肝炎表面抗原、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、肝硬化以及包膜完整性無關(guān)。
　　 6、免疫組化顯示肝癌組織、癌邊緣組織及對(duì)應(yīng)非癌組織的細(xì)胞漿內(nèi)均有C-IAP2蛋白表達(dá)。C-IAP2蛋白在癌邊緣組織、癌組織以及非癌組織的陽性表達(dá)率分別為86

13、.7％，69.3％和26.7％(X2＝60.057，P＜0.001)。
　　 7、肝癌組織中C-IAP2蛋白陽性表達(dá)率與腫瘤分化程度，TNM分期，AFP水平，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，癌栓以及預(yù)后有關(guān)(P＜0.05)，C-IAP2陽性表達(dá)率隨著分化程度的降低而升高，TNM分期中Ⅲ-Ⅳ期的陽性表達(dá)率較Ⅰ-Ⅱ期高，AFP＞400ug/L的患者較AFP＜400ug/L的患者陽性表達(dá)率高，術(shù)前有癌栓的患者較無癌栓者陽性表達(dá)率高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無淋巴

14、結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達(dá)率高，C-IAP2陽性高表達(dá)組術(shù)后復(fù)發(fā)率最高，低表達(dá)組次之，陰性表達(dá)組最低。而與患者性別、年齡、乙型肝炎表面抗原、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、肝硬化、包膜是否完整無關(guān)（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、C-IAP2mRNA和蛋白在三種不同侵襲潛能肝癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，侵襲轉(zhuǎn)移潛能最強(qiáng)的HCCLM3表達(dá)最高，SMMC7721次之，無侵襲轉(zhuǎn)移潛能的HepG2表達(dá)最低，C-IAP2mRNA和蛋白的表達(dá)同肝癌細(xì)胞

15、的侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。
　　 2、肝癌組織中C-IAP2mRNA的表達(dá)量較對(duì)應(yīng)的非癌組織明顯升高，C-IAP2蛋白在癌邊緣組織陽性表達(dá)率最高，癌組織次之，非癌組織最低。C-IAP2mRNA和蛋白在肝癌組織中的表達(dá)與患者術(shù)前有無癌栓、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤病理分化類型、甲胎蛋白水平、TNM分期以及預(yù)后有關(guān)，而與患者其他臨床特征無關(guān)，這表明C-IAP2的表達(dá)水平可能影響原發(fā)性肝癌的腫瘤生物學(xué)特性。
　　 3、三種不同侵襲轉(zhuǎn)移