TRIM24在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌是世界第五大最常見的腫瘤，全球每年約有100萬人罹患此病以及因此病死亡。盡管有關(guān)原發(fā)性肝癌的分子生物學(xué)特性以及其發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究繁多，以及診斷技術(shù)的顯著進(jìn)步與外科治療水平的提高，但原發(fā)性肝癌患者的預(yù)后仍然不太理想。原發(fā)性肝癌外科手術(shù)切除后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)65％以上，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是影響原發(fā)性肝癌預(yù)后的主要因素之一，因此，研究HCC的分化增殖及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移傾向的分子機(jī)制，對(duì)HCC的病程進(jìn)展、預(yù)后評(píng)估有重要意義。近年來，多項(xiàng)研究表明，

2、TRIM24（也稱作Tif1α）作為TRIM(tripartite motif)家族重要成員之一，參與了細(xì)胞凋亡、周期調(diào)控等重要的生命過程，高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，與腫瘤的分化、增殖及發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，但是在小鼠的肝癌研究中，它是一個(gè)肝臟特有的腫瘤抑制因子。然而在人類的HCC中，還沒有任何關(guān)于TRIM24蛋白表達(dá)情況及其與臨床病例參數(shù)關(guān)系研究的報(bào)道。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，H

3、CC)患者中腫瘤組織及非癌組織中TRIM24蛋白的表達(dá)情況，并分析TRIM24蛋白的表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。采用siRNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染HepG2干擾TRIM24的表達(dá)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TRIM24蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期蛋白與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化情況以及采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾TRIM24對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，體外研究TRIM24在HCC的發(fā)生發(fā)展中所起的作用，為HCC的臨床診斷、病程進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估提供新的線索。<

4、br>　　 方法：⑴收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科2010年11月～2012年7月接受手術(shù)治療的HCC患者的組織標(biāo)本，標(biāo)本均在離體2小時(shí)內(nèi)取材固定，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。⑵采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)83例HCC患者的癌組織以及相對(duì)應(yīng)的非癌組織中的TRIM24蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步分析癌組織中的TRIM24蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。⑶采用熒光定量PCR檢測(cè)LO2及五種不同侵襲轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞株HepG2、SMCC-7721、97L、9

5、7H、HCCLM3中TRIM24mRNA的表達(dá)情況，篩選出靶細(xì)胞。⑷采用siRNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HepG2干擾TRIM24表達(dá)，收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取及流式細(xì)胞檢測(cè)。⑸Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TRIM24蛋白表達(dá)以及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況。流式細(xì)胞周期檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期變化;流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后凋亡情況。⑹統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，TRIM24在癌組織和

6、非癌組織中蛋白陽性表達(dá)率的比較，以及在不同臨床病理特征情況下TRIM24在癌組織中的陽性表達(dá)率的比較均采用Pearson Chi-Square檢驗(yàn)。HCC患者臨床預(yù)后的影響因素分析采用Cox多因素回歸分析。TRIM24的蛋白與患者術(shù)后無瘤生存期的關(guān)系采用生存分析（Kaplan-Meier曲線，log-rank法）。熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT進(jìn)行處理，每個(gè)樣本重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各樣本平均CT(threshold cy

7、clenumber)值和ΔCT值(ΔCT=CT TRIM24-CTGAPDH)，計(jì)算2-ΔΔCt（ΔΔCT=ΔCT目的-ΔCT對(duì)照），其數(shù)值表示目的表達(dá)值相對(duì)于對(duì)照表達(dá)值的相對(duì)倍數(shù)，計(jì)量資料以(X)±SD表示。LO2及五種不同侵襲潛能肝癌細(xì)胞株TRIM24 mRNA的比較采用方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期數(shù)據(jù)的比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，采用雙側(cè)性檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：①免疫組化檢測(cè)TRIM2483

8、例肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本中的表達(dá)，結(jié)果顯示:TRIM24在癌組織中表達(dá)陽性51例(51/83，61.4％)，相應(yīng)的非癌組織表達(dá)陽性4例(4/83，4.8％)。TRIM24的陽性表達(dá)與患者AFP水平，病理分化程度，術(shù)后復(fù)發(fā)，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及術(shù)后無瘤生存時(shí)間相關(guān)，具體為AFP≥400ug/L患者TRIM24陽性率顯著高于AFP＜400ug/L患者(P=0.036);病理分化程度越低，TRIM24表達(dá)陽性率越高(P=0.004);TRIM24表達(dá)陽性率在

9、術(shù)后復(fù)發(fā)患者(P=0.000006)及發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移患者(P=0.004)中顯著高于無復(fù)發(fā)及無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移者;TRIM24表達(dá)陽性的患者術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間顯著低于表達(dá)陰性者(P=0.002)。單因素回歸分析結(jié)果表明肝硬化及TRIM24是影響HCC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因素，Cox多因素回歸分析表明TRIM24表達(dá)陽性患者的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)是表達(dá)陰性患者的5.327倍（HR=5.327;95％可信區(qū)間2.218-12.795; P＜0.01）。Kapla

10、n-Meier生存分析顯示TRIM24陽性患者的無瘤生存率明顯低于TRIM24陰性患者(P=0.000017)，提示TRIM24表達(dá)陽性的HCC患者預(yù)后不良。②熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞株中TRIM24 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示:以正常人肝細(xì)胞株LO2為對(duì)照，HepG2中mRNA表達(dá)為LO2的10倍(P＜0.05)，其余肝癌細(xì)胞株與LO2無明顯差異(P＞0.05)。③Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染siTRIM24后HepG2中TRIM24

11、蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染前明顯下降，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白中，促凋亡因子如p53、Bax、Caspase-8表達(dá)上調(diào)，而抑凋亡蛋白Bcl-2及Survivin表達(dá)下調(diào);細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1與CDK4表達(dá)下降;而EMT相關(guān)蛋白中E-cadherin表達(dá)增多，Snail、Slug、Vimentin及β-catenin表達(dá)減少。④流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示:干擾TRIM24表達(dá)后細(xì)胞凋亡比例增高;流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示在抑制TRIM

12、24的表達(dá)后，細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞比例增多(P＜0.05)，S期(P＜0.05)與G2期比例減少，表明細(xì)胞周期阻滯在G1期。
　　 結(jié)論：⑴HCC癌組織中TRIM24蛋白的表達(dá)影響HCC的生物學(xué)特性，對(duì)肝細(xì)胞癌的預(yù)后評(píng)估有一定的臨床意義。⑵siTRIM24干擾實(shí)驗(yàn)表明TRIM24表達(dá)的上調(diào)在HepG2細(xì)胞中起抑制細(xì)胞凋亡的作用。⑶TRIM24可能是通過調(diào)節(jié)部分關(guān)鍵性的細(xì)胞周期蛋白對(duì)細(xì)胞周期起促進(jìn)作用。⑷TRIM24可能是通過促進(jìn)