16SrRNA通用引物在血小板污染檢測中的應(yīng)用.pdf

1、目的：血小板需要在(20±2)℃的有氧條件下保存(保存期為5天)，這樣的條件有利于細(xì)菌的生長。輸注細(xì)菌污染的血小板會(huì)引起嚴(yán)重的敗血癥，嚴(yán)重的有可能導(dǎo)致患者死亡。減少這種敗血癥的發(fā)生是目前輸血領(lǐng)域十分關(guān)注的問題。目前，許多輸血前細(xì)菌污染的檢測方法已經(jīng)被血液中心采用，以減少輸血相關(guān)的敗血癥的發(fā)生。血液全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)目前被認(rèn)為是檢測血小板細(xì)菌污染的金標(biāo)準(zhǔn)。這種方法目前已經(jīng)被大多數(shù)的血液中心采用，來檢測血小板中的細(xì)菌污染。這種方法用于檢測血

2、小板中污染的細(xì)菌是有效的，但同時(shí)也有不足。主要是由于其需要的檢測時(shí)間較長。因此需要有一種更有效的方法來檢測血小板中的細(xì)菌污染。這種方法應(yīng)簡單、足夠靈敏并且可以檢測到所有有臨床意義的細(xì)菌。還要有高度的特異性，并且快速，在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成，允許在血小板發(fā)送到臨床前或輸注給患者前得出準(zhǔn)確的結(jié)果。有文獻(xiàn)報(bào)道，以16SrRNA基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)合成細(xì)菌的通用引物，可以檢測各種細(xì)菌，并且具有靈敏度高，快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)。本文將此方法加以改進(jìn)，用于血小板污染菌

3、的檢測并與全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)(BacT/AL,ERT，bioMérieux)相對(duì)比。 方法：收集保存24小時(shí)和48小時(shí)的血小板標(biāo)本。提取血小板中的細(xì)菌DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增使用針對(duì)細(xì)菌的16SrDNA基因設(shè)計(jì)通用引物。為了更好的鑒定細(xì)菌的種類，同時(shí)引入細(xì)菌的16S～23SrRNA區(qū)問引物。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ消化30分鐘。酶切產(chǎn)物稀釋20倍，用ABI PRISM 310檢測酶切產(chǎn)物的多態(tài)性。同時(shí)，用Bac

4、T/ALERT全自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)檢測同一份血小板中是否有細(xì)菌污染。用無菌三蒸水1：10<'n>系列稀釋大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，取各稀釋度樣本1ml于Ep管中，使用本實(shí)驗(yàn)方法，以能檢測到細(xì)菌的最低濃度為本方法的靈敏度。加入Sau3A I(1U/PCR)，以去除Taq酶中可能存在的污染DNA，保證本實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)共收集了保存期的血小板標(biāo)本276份，其中保存24小時(shí)的血小板標(biāo)本為144份，保存48小時(shí)的血

5、小板標(biāo)本為132份。檢測到2份樣本(占0.7246﹪)有細(xì)菌污染，污染的細(xì)菌分別為金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。使用全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)(BacT/ALERT，bioMérieux)檢測到陽性信號(hào)的時(shí)間分別為20.8和58.5小時(shí)左右。我們還從一份臨床返回的有輸血反應(yīng)的標(biāo)本中檢測到了表皮葡萄球菌。使用全自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)(BacT/ALERT，bioMérieux)檢測到陽性信號(hào)的時(shí)間大約為35.6小時(shí)。用系列稀釋的方法得出本方法的檢測靈敏度為