血小板制品細(xì)菌污染核酸檢測(cè)方法的建立和評(píng)價(jià).pdf

1、近幾年來(lái)，隨著輸血引起的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)的降低以及濃縮血小板制品(platelet concentrates，PCs)在臨床上的廣泛應(yīng)用，血小板制品的細(xì)菌污染問(wèn)題受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。國(guó)外研究表明單采血小板的細(xì)菌污染率為1:3000，混合血小板的細(xì)菌污染率為1:2000，輸注每單位血小板可能產(chǎn)生細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)是傳播HIV-1、HCV、HBV和HTLV-I/II病毒風(fēng)險(xiǎn)總和的50-250倍。因此，血小板輸注后細(xì)菌感染引起敗血癥已成為發(fā)生

2、幾率最高、后果亦相對(duì)嚴(yán)重的感染性輸血風(fēng)險(xiǎn)。 目前，檢測(cè)血小板制品中是否存在細(xì)菌污染的方法主要有BacT/Alert 3D全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)、Pall eBDS及Scansystem檢測(cè)系統(tǒng)。其中BacT/Alert 3D全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)在發(fā)達(dá)國(guó)家得到了廣泛應(yīng)用，該系統(tǒng)敏感性高、結(jié)果可靠、操作也相對(duì)簡(jiǎn)單。然而細(xì)菌培養(yǎng)的方法所需檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)成本較高，在實(shí)際工作中開展仍有一定的困難，故我國(guó)目前尚未開展血小板細(xì)菌污染的常規(guī)檢測(cè)。

3、 近年發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)憑借其快速、靈敏度高等特點(diǎn)，被國(guó)外一些學(xué)者引入到血小板制品細(xì)菌污染的檢測(cè)中來(lái)。然而由于缺乏高效、簡(jiǎn)便的細(xì)菌基因組DNA提取方法及有效控制反應(yīng)體系中潛在細(xì)菌基因組DNA污染的手段，致使核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)血小板制品進(jìn)行細(xì)菌篩查的方法仍不能有效的應(yīng)用于臨床。 針對(duì)以上問(wèn)題本研究從抽提方法入手，選取較難裂解的革蘭氏陽(yáng)性菌-金黃色葡萄球菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，分析比較五種經(jīng)典的細(xì)菌基因組DNA抽提方法。結(jié)

4、果表明，在五種抽提方法中Chelex-100法抽提效率較高。為進(jìn)一步提高其抽提效率，本研究對(duì)Chelex-100法進(jìn)行了改良，使其對(duì)細(xì)菌的最低檢測(cè)下限達(dá)到0.2CFUs/PCR(相當(dāng)于10CFUs/ml)。 本研究針對(duì)細(xì)菌16s rDNA基因保守序列，設(shè)計(jì)了通用引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，為降低檢測(cè)體系中潛在的細(xì)菌基因組DNA污染對(duì)PCR檢測(cè)靈敏度和特異性的影響，本研究對(duì)PCR體系進(jìn)行優(yōu)化，利用Microcon YM-100

5、離心超濾裝置及Ultrafree-MC雙重過(guò)濾法有效的在擴(kuò)增前控制PCR反應(yīng)體系中潛在的細(xì)菌基因組DNA污染，降低了反應(yīng)背景，使陰性對(duì)照Ct值大于34；同時(shí)依此方法檢測(cè)的最低含菌量組(0.2-0.3CFUs/PCR)Ct值小于30，兩者Ct值相差>4，經(jīng)t檢驗(yàn)證明兩者結(jié)果有顯著性差異(P<0.001)。因此，可以看出雙重過(guò)濾法進(jìn)一步提高了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的特異性，在降低背景的基礎(chǔ)上提高了檢測(cè)的靈敏度。在建立起針對(duì)細(xì)菌核酸檢測(cè)法的基

6、礎(chǔ)上，本研究對(duì)該檢測(cè)體系的實(shí)用性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，在血小板制品常見污染菌株的檢測(cè)中，該檢測(cè)體系的靈敏度均達(dá)到0.2-0.3CFUs/PCR，其擴(kuò)增Ct值與陰性對(duì)照之間具有顯著差異(P<0.001)。同時(shí)與BaeT/ALERT 3D全自動(dòng)細(xì)菌培養(yǎng)系統(tǒng)的平行實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)本研究?jī)?yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法結(jié)果可靠，其靈敏度和特異性均為100％，K=1.000。 將該實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法應(yīng)用于917例(470陰性標(biāo)本與447例

7、陽(yáng)性標(biāo)本)臨床標(biāo)本的檢測(cè)中，運(yùn)用ROC工作曲線對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)曲線下面積為1.000，表明該檢測(cè)方法對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本的檢出率高達(dá)100％，且重復(fù)性好，具有較高的診斷價(jià)值。 除正常情況以外，細(xì)菌在外界因素的作用下會(huì)發(fā)生細(xì)胞壁缺損，同時(shí)又保持原有致病性，稱為細(xì)菌L型。臨床上出現(xiàn)的許多慢性反復(fù)發(fā)作的感染基本上都與細(xì)菌L型相關(guān)。由于L型細(xì)菌在低滲溶液中易裂解死亡，在普通培養(yǎng)檢測(cè)系統(tǒng)中往往發(fā)生漏檢，這對(duì)血液安全產(chǎn)生潛在的威脅。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)本

8、研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌L型的檢測(cè)，本研究成功地誘導(dǎo)出金黃色葡萄球菌L型，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到L型細(xì)菌的存在，提示我們?cè)摲椒梢杂行z測(cè)到血液制品中存在的L型細(xì)菌，為血液制品的安全提供更好的保障。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法無(wú)論在操作步驟，檢測(cè)時(shí)間或檢測(cè)靈敏度及特異性上都有很大優(yōu)勢(shì)，十分適用于血小板制品發(fā)放前的快速檢測(cè)。雖然本研究目前僅限于實(shí)驗(yàn)室研究階段，尚未對(duì)大規(guī)模臨床標(biāo)本檢測(cè)的可操作性、