兩種核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立.pdf

1、“快速簡(jiǎn)便”是現(xiàn)代分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向。近年來或基于DNA/RNA生物合成機(jī)制，或基于某些具有特殊功能的核酸酶，產(chǎn)生了一系列核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)反應(yīng)儀器要求低，在某一恒定溫度下即可進(jìn)行反應(yīng)。這一獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，極其適合開發(fā)價(jià)格低廉、高靈敏度、高特異性的現(xiàn)場(chǎng)診斷產(chǎn)品。本研究對(duì)切刻內(nèi)切酶核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(NEMA)和依賴于核酸序列的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(NASBA)進(jìn)行改進(jìn)，并以沙門氏菌(Salmonella)和單核細(xì)胞增生李斯特氏

2、菌(Listeria monocytogenes)為目標(biāo)菌建立各自的NEMA和NASBA檢測(cè)方法。
　　 對(duì)傳統(tǒng)NEMA技術(shù)引入切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的方法進(jìn)行了改進(jìn)，突破了限制NEMA技術(shù)應(yīng)用的瓶頸。傳統(tǒng)NEMA反應(yīng)需要四條引物，本研究創(chuàng)新性的加入模板預(yù)處理步驟之后，使得反應(yīng)只需要兩條引物即可，大大提高了檢測(cè)方法的靈敏度和特異性，所建立檢測(cè)方法的靈敏度比傳統(tǒng)PCR-瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)法高一個(gè)數(shù)量級(jí)。經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，所作改進(jìn)尚屬首

3、次。
　　 傳統(tǒng)NASBA檢測(cè)技術(shù)大多以RNA核酸序列為檢測(cè)目標(biāo)。本研究嘗試建立以DNA核酸序列為檢測(cè)目標(biāo)的NASBA技術(shù)，改進(jìn)后的NASBA技術(shù)降低了對(duì)操作環(huán)境的要求，拓寬了NASBA技術(shù)的應(yīng)用范圍。同時(shí)NASBA技術(shù)與核酸薄層層析檢測(cè)技術(shù)(Nucleic Acid Thin-layer Chromatography)的結(jié)合，也使得NASBA擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)擺脫了對(duì)精密儀器的依賴，為技術(shù)的普及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，所