基于DNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的轉(zhuǎn)基因作物快速檢測(cè)方法研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因作物的推廣和商業(yè)化種植在帶給人們巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，其潛在風(fēng)險(xiǎn)卻也飽受爭(zhēng)議，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因具有十分重要的意義，事關(guān)國際政治和經(jīng)濟(jì)利益。傳統(tǒng)基于外源蛋白分析的檢測(cè)方法具有明顯的局限性，而基于外源核酸分析的檢測(cè)方法在對(duì)操作人員有較高要求的同時(shí)又受制于專業(yè)、昂貴、體積龐大的儀器設(shè)備。為了開發(fā)簡(jiǎn)單、快速、便攜基于核酸分析的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法，本課題以抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)、科豐6號(hào)和克螟稻1號(hào)為研究材料，以交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(CPA)

2、和環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)為擴(kuò)增方法，以核酸擴(kuò)增過程中的副產(chǎn)物H+和磷酸根為檢測(cè)對(duì)象，分別建立了電化學(xué)無標(biāo)記的核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法和新型可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法，并在以上研究基礎(chǔ)上提出了基于邏輯判斷的轉(zhuǎn)基因具體品系的快速鑒定策略，開發(fā)出紙上可視化點(diǎn)陣列鑒定轉(zhuǎn)基因品系的方法。
　　本文的主要內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　1)針對(duì)轉(zhuǎn)基因通用元件T-nos的基因序列建立了用于轉(zhuǎn)基因作物快速篩選的CPA體系，設(shè)計(jì)了6條引物，包括2條外引

3、物、2條交叉引物和2條檢測(cè)引物，特異性識(shí)別T-nos序列的8個(gè)區(qū)域;通過使用SYTO9作為熒光染料實(shí)現(xiàn)了對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，考察了該體系的特異性和檢測(cè)靈敏度，并與傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)效果進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明:所建立的CPA體系能夠特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中的nos基因;其檢測(cè)限約為103拷貝水稻基因組DNA，相比傳統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，能夠達(dá)到相同的檢測(cè)限但需要更短的時(shí)間（節(jié)約10 min左右）;除此之外，能夠檢測(cè)至少0.5％摻雜的

4、實(shí)際樣本，足以滿足國際上大部分國家和地區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的需求。綜上所述，CPA體系能夠作為快速、簡(jiǎn)便的核酸擴(kuò)增方法取代傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光PCR，表現(xiàn)為需要更短的時(shí)間、更簡(jiǎn)單的反應(yīng)儀器。
　　2)以核酸擴(kuò)增過程中的副產(chǎn)物H+為檢測(cè)對(duì)象，建立了基于pH變化檢測(cè)的電化學(xué)無標(biāo)記核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法，搭建了實(shí)時(shí)分析和終點(diǎn)檢測(cè)兩種形式的檢測(cè)平臺(tái)，結(jié)果表明:最適合用于pH檢測(cè)的CPA體系(pH-CPA)的組成為50mMK+，15 mM NH4+，3mM的

5、KOH添加;使用商業(yè)化pH計(jì)可以對(duì)pH-CPA擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，將擴(kuò)增過程中的pH變化最快的點(diǎn)作為pH-CPA反應(yīng)的信號(hào)閾值，通過對(duì)擴(kuò)增過程中得到pH變化曲線進(jìn)行求導(dǎo)，得到曲線的局部最小值即為pH-CPA的信號(hào)閾值，信號(hào)閾值所對(duì)應(yīng)的時(shí)間即為“Time to threshold”，用tth表示;利用tth分析，pH-CPA擴(kuò)增方法表現(xiàn)出可靠的定量分析性能，10倍差異的模板，tth大約差3;相比實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的方法，該電化學(xué)檢測(cè)方法節(jié)省大約2

6、0％的時(shí)間;此外，通過使用可拋棄的pH敏感的絲網(wǎng)印刷微電極，初始模板量為103拷貝基因組DNA的陽性樣本擴(kuò)增前后峰值電位差△Ep發(fā)生28.3 mV的變化，對(duì)應(yīng)為0.38個(gè)pH，與使用商業(yè)化pH計(jì)實(shí)時(shí)分析得到的結(jié)果大致相同（約0.35 pH）。綜上可知，以溶液中的H+濃度的變化為檢測(cè)對(duì)象能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)或是終點(diǎn)的電化學(xué)檢測(cè)，無需龐大的儀器設(shè)備，與恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，使得核酸分析過程更便攜、簡(jiǎn)單易用，由于電化學(xué)檢測(cè)本身具有易于集

7、成化的特性使得該方法具有更好的應(yīng)用前景。
　　3)通過檢測(cè)核酸擴(kuò)增過程中的Pi信號(hào)的產(chǎn)生，建立了基于Pi分析的可視化核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，詳細(xì)系統(tǒng)地考察了該方法應(yīng)用于不同擴(kuò)增體系的可行性，并設(shè)計(jì)了配套的可拋棄的防污染裝置，建立了完整的快速、便攜、可視化核酸擴(kuò)增檢測(cè)體系，結(jié)果表明:核酸擴(kuò)增條件下非擴(kuò)增特異性Pi產(chǎn)生的唯一來源是dNTP分解，影響dNTP分解最主要的因素是反應(yīng)溫度條件，傳統(tǒng)PCR（加熱/冷卻熱循環(huán)，40 cycles）

8、條件下約13％的dNTP分解產(chǎn)生Pi，而恒溫CPA擴(kuò)增條件下(63℃，1 h)則僅有2％的dNTP發(fā)生分解;在擴(kuò)增特異性Pi信號(hào)產(chǎn)生情況的研究中，經(jīng)過PPase處理的CPA陽性樣本約產(chǎn)生2.86 mM的Pi，是不經(jīng)過PPase處理的陽性樣本產(chǎn)生量的36倍，陰性樣本產(chǎn)生量的53倍（經(jīng)過PPase處理），而PCR體系陽性樣本（經(jīng)過PPase處理）則產(chǎn)生約0.5 mM的Pi，相應(yīng)陰性樣本（經(jīng)過PPase處理）產(chǎn)生Pi0.15 mM;通過對(duì)dN

9、TP利用率的計(jì)算可以得到CPA擴(kuò)增體系中有大約87.5％的dNTPs被用于擴(kuò)增，將近3.36％發(fā)生非擴(kuò)增特異性降解;而PCR擴(kuò)增體系則僅有22.3％的dNTPs被用于擴(kuò)增反應(yīng)，18.6％的dNTPs降解;使用該可視化方法檢測(cè)CPA，僅需擴(kuò)增15 min即可完成對(duì)103拷貝基因組DNA的檢測(cè)，相比第3章基于pH變化的電化學(xué)檢測(cè)核酸擴(kuò)增的方法節(jié)約將近50％的時(shí)間;通過考察該方法在LAMP擴(kuò)增中的應(yīng)用，得知該方法并不局限于對(duì)CPA擴(kuò)增體系的檢

10、測(cè)，具有能夠應(yīng)用于其他種類恒溫?cái)U(kuò)增體系的巨大潛力。綜上可知，以溶液中的Pi信號(hào)的產(chǎn)生為檢測(cè)對(duì)象能夠非常直接、簡(jiǎn)便地對(duì)核酸擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行判斷，可視化信號(hào)非常明顯、反應(yīng)速度快，更大程度地發(fā)揮了恒溫?cái)U(kuò)增用于現(xiàn)場(chǎng)、資源匱乏條件下進(jìn)行核酸分析的優(yōu)勢(shì)。
　　4)建立了基于邏輯判斷的轉(zhuǎn)基因品系鑒定方法，以國內(nèi)3種常見抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻（華恢1號(hào)、科豐6號(hào)和克螟稻1號(hào)）為研究對(duì)象，篩選出能夠有效獲取該組對(duì)象基因轉(zhuǎn)化詳細(xì)信息的基因組合，以LAMP為恒溫?cái)U(kuò)

11、增方法示例，通過Mo-Sb-Vc體系對(duì)結(jié)果顯色，陽性結(jié)果表現(xiàn)為藍(lán)色計(jì)作“1”，陰性結(jié)果顯示為無色計(jì)作“0”，根據(jù)樣品檢測(cè)結(jié)果得到的類似“1101”的結(jié)果進(jìn)行邏輯判斷，最終鑒定出轉(zhuǎn)基因具體品系，結(jié)果表明，同步檢測(cè)sps、 nos、CaMV35S和cry1Ac基因需要擴(kuò)增約35 min，轉(zhuǎn)基因摻雜度低至0.5％的樣品仍能產(chǎn)生明顯的顏色變化，檢測(cè)結(jié)果基本不受深加工工藝過程的影響;使用Whatman1級(jí)Chr層析紙作為基質(zhì)，使用磷酸顯色試劑對(duì)其